天麻萌發菌胞外酶活性變化規律研究△

葉夢娜，陳向東，王忠巧，蘭進，張薇薇，宋明海，王憲楠，馬琳

1.天津中醫藥大學，天津 301617；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.彝良縣天麻產業開發辦公室，云南 昭通 657600；4.撫松縣參王植保有限責任公司，吉林 撫松 134500

天麻GastrodiaelataBl.是蘭科(Orchidaceae)天麻屬(Gastrodia)多年生草本植物，是一種高度退化的蘭科植物。其種子細小量大、無胚乳，研究發現天麻種子萌發是由種子萌發菌提供營養。萌發菌侵入天麻種子后，天麻種子消化侵入的菌絲獲得營養，進而萌發形成原球莖。目前，天麻種子萌發率較低，萌發菌多代繁殖不斷退化，直接影響天麻產量和質量。因此，篩選優質萌發菌是亟待解決的問題。胞外酶是萌發菌在其生長發育過程中參與培養基中養分的分解和吸收的高效工具，不同胞外酶活性的變化在一定程度上反映培養過程中菌絲體生長及相關產物代謝的情況[1]。本研究通過對03、06萌發菌不同時期的胞外酶活性測定及菌株生長量測量，為天麻有性繁殖生產篩選優良菌株提供參考。

1 材料

1.1 供試菌株

天麻萌發菌菌株03、06，由中國醫學科學院北京協和醫學院藥用植物研究所生物技術中心提供。

1.2 試劑

2，2-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：L1803054)；苯酚(西隴化工股份有限公司，批號：1703042)；所有試劑均為分析純。

1.3 儀器

TG16G型離心機(天津廣豐科技有限公司)；BioSpectrometerfluorescence型分光光度計(德國Eppendorf)；PHS-3C型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)。

2 方法

2.1 菌絲培養皿培養

菌絲培養采用改良固體PDA培養基，培養基配制后高壓滅菌，定量倒入120 mm無菌培養皿中，定量接種。25 ℃暗培養，觀察菌落形態，采樣供內轉錄間隔區(ITS)分子鑒定用。

2.2 菌絲試管培養

試管菌絲培養采用木屑-麥麩培養基，按料水比1∶1.5制作培養基，定量裝入大試管中，高壓滅菌。

2.3 生長速度的測定

接種第5天起測量菌絲生長量，除以生長天數得到菌株的平均生長速度，每5 d測量1次至長滿試管為止，每菌株測量3個試管，取平均數。

2.4 菌株菌落形態及ITS分子鑒定

采用Plant Genomic DNA Kit試劑盒(離心柱型)提取03菌株和06菌株的DNA，采用真菌通用引物ITS-1(5′ TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS-4(5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對ITS序列進行PCR擴增。PCR 反應體系50 μL：2×TaqMaster Mix 25 μL，引物ITS-1 2 μL，引物ITS-4 2 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O補齊至50 μL。反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃ 55 s，30個循環；72 ℃延伸 2 min，4 ℃保存。將試驗陽性PCR產物送至北京六合華大基因科技有限公司進行測序，將測序結果整理后提交National Center for Biotechnology Information 數據庫，利用BLAST進行序列比對，下載相似序列后利用Mega 7.0的鄰接(NJ)法(Bootrap：1000；Gaps/Missing Data Pairwise Deletion；Model：Kmura 2-parameter；Substiutions to Include：Tranations+Transversion)構建系統發育樹。

2.5 萌發試驗

將03菌株和06菌株分別與4 ℃貯藏30 d的紅天麻種子進行拌播，以紫萁小菇作為對照，并在MS培養基上進行無菌萌發實驗，60 d時統計萌發率。

2.6 胞外酶活性測定

隨機取菌絲生長線下的培養基1.0 g，加入5 mL磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液(pH=4.0，0.2 mol·L-1)，室溫浸提4 h，12 000 r·min-1(離心半徑為8.8 cm)離心15 min，吸出1 mL上清液于10 mL量瓶中定容至刻度，用于胞外酶活性測定。

采用2,2-聯氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)法[2]測定漆酶活性，3,5-二硝基水楊酸(DNS)法[3]分別測定纖維素酶活性、木聚糖酶活性、果膠酶活性及淀粉酶活性。

ABTS法：將0.5 mL 0.5 mmol·L-1ABTS與1.0 mL Na2HPO4-C6H8O7緩沖液混合均勻，加入0.5 mL稀釋后的酶液。記錄420 nm處3 min內的吸光度變化，1個酶活單位定義為反應體系中每分鐘催化1 μmol ABTS所需酶量。

DNS法：在刻度試管中分別加入1.5 mL用0.1 mol·L-1的醋酸緩沖液(pH=4.6)配制的1% CMC-Na溶液，0.1 mL稀釋后的酶液，40 ℃水浴保溫30 min，取出后立即加入1.5 mL DNS試劑，沸水浴加熱5 min，待冷卻后用蒸餾水稀釋至10 mL，于500 nm測定吸光度。1%木聚糖溶液、1% 果膠溶液、1% 淀粉溶液，與1% CMC-Na溶液配制方法和測定方法相同。不同的是，測定木聚糖酶活力時，稀釋至20 mL后測定吸光度；測定淀粉酶活力時，于50 ℃水浴保溫30 min。

以上測定過程中空白對照均為加熱滅活后的稀釋酶液，分別按葡萄糖、木糖和半乳糖醛酸標準曲線，計算底物被酶分解的葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸的含量，1個酶活單位定義為每分鐘生成1 μmol葡萄糖、木糖及半乳糖醛酸所需要的酶量。

2.7 繪制標準曲線

葡萄糖標準曲線：移取0～1.0 mL的0.1 mg·mL-1葡萄糖標準液至10 mL量瓶中，用蒸餾水補充至2.0 mL，空白對照為2.0 mL蒸餾水。采用苯酚-濃硫酸法[3]測定420 nm的吸光度，繪制葡萄糖標準曲線為Y=41.986X+0.002 2(r=0.999 8)。

木糖標準曲線：移取0～1.0 mL的5.0 mg·mL-1木糖標準液至25 mL量瓶中，用醋酸緩沖液補充至1.0 mL，空白對照為1.0 mL醋酸緩沖液。加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴5 min后用醋酸緩沖液定容至20 mL。測定500 nm下的吸光度，繪制木糖標準曲線為Y=2.366 9X-0.008 5(r=0.999 1)。

半乳糖醛酸標準曲線：半乳糖醛酸標準液質量濃度為1 mg·mL-1，除定容至10 mL后測定吸光度，其余步驟同木糖標準曲線，測得半乳糖醛酸標準曲線為Y=12.206X-0.017 6(r=0.999 1)。

2.8 酶活性計算

漆酶活性用公式(1)計算，其他酶活性用公式(2)計算。

(1)

(2)

式中：ε：ABTS吸光系數36 000 L·mol-1·cm-1；V酶：加入酶液的體積(L)；V總：反應體系總體積(L)；m：根據標準曲線算得的質量(μg)；M：摩爾質量；t：反應時間；n：稀釋倍數；單位：U·L-1。

2.9 數據處理

運用Excel表格統計處理數據結果，采用SPSS 17.0進行獨立樣本t檢驗以比較數據差異性。

3 結果與分析

3.1 菌株菌落形態及ITS分子鑒定

2種菌株菌絲呈絨毛狀、邊緣整齊，06菌株菌絲較03菌株菌絲潔白、濃密(見圖1)，03菌株生長速度快于06菌株。

注：A.03菌株；B.06菌株。圖1 2株萌發菌菌株菌落形態

2株萌發菌ITS的PCR擴增結果顯示其序列大小在750 bp 左右。菌株與Mycena中的ITS序列具有99%的高度相似性，結合菌株菌落形態認為，03菌株和06菌株均為小菇屬萌發菌。系統發育樹見圖2。

3.2 萌發實驗

培養60 d時，03、06菌株與紫萁小菇的萌發率分別為64.0%、42.4%和52.8%，MS培養基上未觀察到種子萌發(見圖3)。

圖2 2株萌發菌菌株系統發育樹

注：A.03菌株拌播種子；B.06菌株拌播種子；C.紫萁小菇；D. MS培養基播種天麻種子。圖3 3株萌發菌及MS培養基上種子萌發情況

3.3 萌發菌生長速度

接種第5天開始，每5 d測量生長量，并換算成生長速度(見表1)，2株萌發菌均在第25天達到生長的高峰，03、06菌株的生長速度分別為0.303、0.295 cm·d-1。第25天以后生長放緩，在生長過程中03菌株的生長速度均大于06菌株，且差異有統計學意義(P<0.05)，結果表明03菌株在生長速度上優于06菌株。

表1 03、06菌株不同時期生長速度 cm·d-1

3.4 不同時期萌發菌胞外酶活性變化

3.4.1漆酶活性 03、06菌株漆酶活性均表現為先增長的趨勢(見圖4)，并在第15天時達到最高值，分別為19.50、19.44 U·g-1；在第20天均降至最低值。培養第21天后06菌株漆酶活性又開始上升，第30天出現第2次高峰，此時06菌株漆酶活性為13.42 U·g-1，是03菌株漆酶活性的1.5倍。第25天以后，06菌株漆酶活性均高于03菌株，差異有統計學意義(P<0.01)。

3.4.2纖維素酶活性 從圖4可見，06菌株纖維素酶活性第10天達到最高值(見圖5)，而03菌株纖維素酶活性則在第15天達到最高值；纖維素酶活性分別為0.54、0.63 U·g-1。達到最高值后纖維素酶活性均開始降低，到第40天時06、03菌株的纖維素酶活性分別降至0.27、0.19 U·g-1，此時06菌株纖維素酶活性比03菌株高42.1%。

注：*P<0.05;**P<0.01;下同。圖4 03、06菌株不同時期胞外漆酶活力變化

圖5 03、06不同時期胞外纖維素酶活力變化

3.4.3木聚糖酶活性 03、06菌株萌發菌木聚糖酶活性變化趨勢與纖維素酶活性相近，也是隨著培養時間的增加呈現先增高后降低的趨勢(見圖6)。不同于纖維素酶活性變化趨勢的是03菌株木聚糖酶活性在第10天達到最高值，而06菌株在第15天達到最高值；在第15天，06菌株的木聚糖酶活性約為03菌株的1.6倍。在培養過程中06菌株的木聚糖酶活性均高于03菌株，統計分析顯示03、06菌株萌發菌木聚糖酶活性差異有統計學意義(P<0.05)。

圖6 03、06不同時期胞外木聚糖酶活力變化

3.4.4果膠酶活性 03、06菌株果膠酶活性變化趨勢與其他酶活力變化趨勢相似(見圖7)，但是達到最高酶活性時間均推遲到培養第25天，03菌株果膠酶活性為2.73 U·g-1，比06菌株高12.3%。在培養不同階段03菌株果膠酶活性均高于06菌株，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖7 03、06不同時期胞外果膠酶活力變化

圖8 03、06不同時期胞外淀粉酶活力變化

3.4.5淀粉酶活性 03、06菌株淀粉酶活性均在培養第15天時達到最高值(見圖8)，06菌株的淀粉酶活性是0.560 U·g-1，比03菌株高41.1%；淀粉酶活性培養第40天時為最低，03、06菌株的淀粉酶活性分別是0.193、0.264 U·g-1；從曲線圖可見在03、06菌株生長過程中，06菌株的淀粉酶活性均高于03菌株，且差異有統計學意義(P<0.05)。

4 討論

ITS序列分析技術是常用的分子生物學鑒定方法，可以檢測和對比傳統形態學無法區分鑒別的相似菌株種間或種內的差別，具有快速、靈敏、準確的優點。本研究將03、06菌株的ITS序列測序后，提交至GenBank數據庫中，建立系統發育樹，結合菌株菌落形態認為03、06菌株為2種不同的小菇屬萌發菌。萌發實驗表明03、06菌株均有促進天麻種子萌發的作用。

在培養前期，2株萌發菌生長速度逐漸增加，均在第25天達到生長的高峰，后期2種菌株生長速度有所減緩。03菌株先于06菌株長滿試管，兩者生長速度存在差異。

萌發菌為木腐菌，其生長與胞外酶活性密切相關。目前對萌發菌胞外酶活性變化規律的研究報道較少，并且只是在液體發酵培養方面，木屑培養基菌株胞外酶活性研究未見報道。一般木材中纖維素、半纖維素和木質素的含量分別為40%～ 50%、10%～ 30%、20%～ 30%，萌發菌生長過程中向胞外分泌的漆酶能加速木質素芳香族高分子化合物的分解；胞外纖維素酶將纖維素分解為纖維二糖和寡糖，最終水解為葡萄糖被萌發菌吸收利用；木聚糖是植物半纖維素的主要組成部分，胞外木聚糖酶可以使其分解[4-8]。在生長階段，兩株萌發菌均分泌了漆酶、纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶和淀粉酶，這5種胞外酶活性變化規律基本一致，但表現出明顯的階段性。不同菌株的同種胞外酶酶活性大小有所差異，03菌株各個時期的木聚糖酶和淀粉酶活性低于06菌株，說明06菌株分解培養基半纖維素類成分的能力強于03菌株。在培養后期06菌株的漆酶活性不降反升，可能是因為前期貯存的營養物質已經不能滿足菌絲迅速生長的需要，從而誘導分泌木質素分解酶以分解利用培養基中的木質素物質獲得營養。在實際生產過程中，萌發菌生長速度緩慢，針對不同的萌發菌菌株，可以采用不同的培養基，以加快菌絲生長和縮短菌種培養周期。

本研究根據2種菌株的生長量、不同時期的胞外酶活性及萌發實驗的研究結果，初步篩選出03為優勢菌株，可為實際生產中對萌發菌培養基進行改進及優質萌發菌的選擇提供科學依據。對于不同萌發菌分解吸收培養基中營養成分的調控機制還需進一步深入研究。