綠薄荷莖葉乙醇提取物對小菜蛾幼蟲解毒酶系的影響

段 雨，吳蘭軍，宋程飛，閆喜中，郝 赤

（山西農業大學農學院，山西太谷030801）

小菜蛾（Plutella xylostellaL.）屬鱗翅目菜蛾科，是十字花科作物重要的世界性害蟲[1-2]。其具有繁殖力高、適應性強和生活周期短等特點，經常造成毀滅性為害，盡管多種殺蟲劑已被用來控制這種有害生物[3-4]，但小菜蛾對大多數殺蟲劑都表現出較高的交叉耐藥性和多重耐藥性，防治效果并不理想[5]。有研究表明，小菜蛾對氯蟲腈、氟苯二酰胺以及相對較新的殺蟲劑二酰胺有抗藥性[6-8]。而植物源農藥由于安全性高、不污染環境和對農產品無殘留等優點，可替代化學農藥的使用。

綠薄荷（Mentha spicataL.），通常被稱為留蘭香，是一種常見的多年生草本植物。全株具有濃烈的清涼香味，常用于涼茶、烹飪以及傳統藥物中[9]。此外，據報道，薄荷具有殺蟲、抗菌、解痙、抗氧化和抗真菌活性等作用[10-12]。

近年來，植物提取物與昆蟲行為之間的化學生態學成為了研究熱點[13-14]。多種植物提取物對昆蟲有引誘、趨避、毒殺和拒食作用[15-16]。有研究顯示，薄荷屬植物，如小葉薄荷、留蘭香和歐薄荷具有殺病蟲活性，表明薄荷已逐漸應用于病蟲害防治[17]。薄荷精油對溫室白粉虱（Trialeurodes vaporariorum）的觸殺作用很強[18]；對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有抑菌活性[19]；對雙斑長跗螢葉甲的驅避率高達74.00% ±5.47%[20]。薄荷還能抑制朱砂葉螨（Tetranychus cinnabarinus）體內酶的活性，最終致其死亡[21]。根據報道[21]，綠薄荷的乙醇提取物對小菜蛾幼蟲的拒食和成蟲的產卵忌避均有顯著作用。但是，目前關于綠薄荷提取物對小菜蛾幼蟲的作用機制尚不明確。

已知許多植物精油和植物提取物會抑制昆蟲體內的解毒酶活性，目前主要是通過測定蟲體內酶系活性的變化來分析其對害蟲的作用機制[21]。有研究表明，植物次生代謝物對昆蟲有毒害作用時，蟲體通過調節解毒酶系的活性，起到解毒和排毒的作用，進而防止或減少逆境脅迫對其造成的危害[22-26]。其中，乙酰膽堿酯酶（AchE）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST-s）最具代表性[27-28]。朱香鎮等[29]研究了2種植物源次生物質對綠盲蝽（Apolygus lucorum）不同齡期幼蟲的谷胱甘肽-S-轉移酶（GST-s）的活性影響，結果表明，綠盲蝽受到不同種類外源次生物質或者不同濃度同種外源次生物質脅迫后，體內解毒酶活性的變化是一個復雜的過程。王瑞龍等[30-31]研究結果表明，斜紋夜蛾（Spodoptera litura）幼蟲取食含有6種植物次生物質的飼料，均提高了GST的活性，說明植物次生物質可誘導斜紋夜蛾體內解毒酶活力，以提高它抵抗有毒物質的能力。據報道，牛至（Origanum vulgareL.）和藜屬植物（Chenopodium albumL.）的精油對AchE具有抑制作用。

本試驗用不同濃度的綠薄荷莖葉提取物喂食小菜蛾3齡幼蟲，測定其體內主要解毒酶的活力，進而判斷綠薄荷莖葉提取物對小菜蛾的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試植物 綠薄荷（Mentha spicataL.）種植于山西農業大學農作站，分離莖和葉以制備提取液。甘藍（Brassica oleraceaL.）種植于山西農業大學溫室，品種是五月慢，供試驗所用。

1.1.2 供試蟲源 試驗所用小菜蛾3齡幼蟲由山西農業大學農學院昆蟲神經行為與感覺生物學實驗室提供，飼養溫度為（25.0±1.0）℃，相對濕度為70% ±5% 。

1.1.3 主 要 試 劑 Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、無水碳酸鈉、無水乙醇和丙酮均購于天津市天力化學試劑有限公司；碘化硫代乙酰膽堿（ATChⅠ）、二硫雙對硝基苯甲酸（DTNB）、乙酸-1-萘酯（α-NA）和1-氯-2，4-二硝基苯（CDNB）均購于梯希愛（上海）化成工業發展有限公司（TCL）；毒扁豆堿購于Fluka；固藍RR鹽購于上海恒遠生物科技有限公司；還原型谷胱甘肽（GSH）購于上海生物工程公司；牛血清蛋白（BSA）購于上海勵瑞生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶液的制備 使用陳立等[32]的浸葉法，將甘藍葉片分別使用質量濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 mg/mL的綠薄荷莖葉乙醇提取物浸泡后喂養小菜蛾3齡幼蟲，12、24、36、48 h后取10只活蟲制備酶液，置于0.5 mL 0.5 mol/L的磷酸緩沖液（pH＝7）中勻漿，15 000 r/min離心15 min，取上清液，作酶原，重復6次。以95% 乙醇處理的甘藍葉片喂食幼蟲，作為對照。根據考馬斯亮藍G-250法測定蛋白質濃度，計算酶活性[32-33]。

1.2.2 小菜蛾幼蟲體內AchE活性測定AchE活力測定參考慕立義[34]的方法，稍作改進。在試管中分別加入10μLATChⅠ、10μLDTNB、160μL0.1 mol/L PBS和20μL酶液，對照為蒸餾水。使用酶標儀測定并記錄在波長412 nm時3 min內吸光度值的變化[32]，計算AchE活性。

1.2.3 小菜蛾幼蟲體內CarE活性測定 參照慕立義[34]的方法，經改進后測定CarE活性。在試管中分別加入10μL毒扁豆堿、160μLα-NA＋固藍RR鹽和10μL酶液，對照為蒸餾水。使用酶標儀測定并記錄在波長450 nm時3 min內吸光度值的變化，計算CarE活性。

1.2.4 小菜蛾幼蟲體內GST-s活性測定 使用改進后慕立義[34]的方法，測定GST-s活性。在試管中分別加入180μL磷酸緩沖液、20μL酶液、10μL GSH和10μL CDNB使反應開始，通過測定340 nm時5 min內吸光度值的變化，計算GST-s活性。

1.3 數據分析

使用SPSS 17.0對試驗數據進行分析，其中，采用ANOVA比較各濃度莖葉提取物處理后的結果在0.05水平上的差異性，采用t-test比較同一濃度下綠薄荷莖和葉提取物處理后的結果在0.05水平上的差異性。

2 結果與分析

2.1 綠薄荷提取物對小菜蛾幼蟲體內AchE活性的影響

2.1.1 綠薄荷莖提取物對小菜蛾AchE活性的影響

由表1可知，12、36、48 h各濃度的綠薄荷莖提取物對幼蟲體內AchE活力均表現出抑制作用。12～24 h處理后小菜蛾體內AchE被激活，酶活力增加，其中，12.5 mg/mL在24 h時酶活力高于對照組；隨著時間的增加，24 h后各處理組開始下降，且低于對照組，表明隨著時間的增加，綠薄荷莖提取物在小菜蛾體內產生抑制Ach水解生成膽堿的物質，降低了幼蟲的解毒能力。

表1綠薄荷莖提取物對小菜蛾幼蟲體內AchE活性的影響 U/（mg·min）

2.1.2 綠薄荷葉提取物對小菜蛾AchE活性的影響

綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內AchE活性的影響如表2所示。

表2綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內AchE活性的影響 U/（mg·min）

從表2可以看出，綠薄荷葉提取物濃度越高對小菜蛾體內AchE活性抑制作用越強。12～24 h，處理后小菜蛾體內AchE被激活，其中，12.5 mg/mL在24 h的酶活力高于對照組；從24 h開始處理組酶活下降，各濃度均低于對照。表明隨著時間的增加，綠薄荷葉提取物在小菜蛾體內產生抑制Ach水解生成膽堿的物質，降低了小菜蛾幼蟲的解毒作用。

2.1.3 綠薄荷莖和葉提取物對小菜蛾AchE作用比較 由圖1可知，在12h低質量濃度（12.5、25.0mg/mL）下的綠薄荷莖提取物對小菜蛾幼蟲體內AchE活力高于葉提取物，而50.0、100.0 mg/mL質量濃度下，二者無差異；24 h時4個不同質量濃度條件下均表現出莖的酶活力高于葉，表明葉提取物對小菜蛾幼蟲體內的AchE作用更強；36 h時，在12.5、50.0 mg/mL質量濃度下，葉提取物的作用強于莖，但在25.0、100.0 mg/mL質量濃度下，效果則相反；48 h時僅50.0 mg/mL質量濃度下，綠薄荷莖提取物的酶活力低于葉，而其他3個濃度相反。濃度越大酶活力越低且同濃度下葉提取物作用后蟲體的酶活力比莖的小，表明綠薄荷莖和葉提取物對小菜蛾幼蟲體內的AchE活力的激活或抑制作用存在一定的差異。

2.2 綠薄荷提取物對小菜蛾幼蟲體內CarE活性的影響

2.2.1 綠薄荷莖提取物對小菜蛾CarE活性的影響

從表3可以看出，各濃度處理后，蟲體的酶活力均為先增高后降低，在24 h時，酶活力最高，且濃度越高，抑制作用越強，僅48 h時，100.0 mg/mL的酶活力高于50.0 mg/mL。其中，在36 h 100.0 mg/mL表現出最強的抑制作用，可能是由于濃度越高，小菜蛾取食量減少，蟲體內累積的有效成分變少，酶活力降低，抑制作用增強。在48 h時處理組的酶活力均低于對照組，表明綠薄荷莖提取物對小菜蛾幼蟲體內CarE活性表現出抑制作用。

表3綠薄荷莖提取物對小菜蛾幼蟲體內CarE活性的影響 U/（mg·min）

2.2.2 綠薄荷葉提取物對小菜蛾CarE活性的影響

由表4可知，24 h時，取食綠薄荷葉提取物的小菜蛾幼蟲體內的CarE活力均大于對照；48 h時，取食綠薄荷葉提取物的小菜蛾幼蟲體內的CarE活力均小于對照，表明在24～48 h綠薄荷葉提取物在小菜蛾體內發揮藥效作用，抑制CarE活力。且在12～24 h，12.5 mg/mL處理后CarE活力劇增，表明受低濃度刺激后CarE被迅速激活。24 h后各處理組的酶活力下降，而對照相反，表明綠薄荷葉提取物在蟲體內發揮作用并抑制小菜蛾自身的解毒功能。

表4綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內CarE活性的影響 U/（mg·min）

2.2.3 綠薄荷莖和葉提取物對小菜蛾CarE作用的比較 由圖2可知，12、36 h時，12.5、25.0、50.0 mg/mL處理組的蟲體內CarE活力高于葉，100.0 mg/mL時表現出葉強于莖；24 h時，4個不同濃度下均表現出莖的酶活力高于葉；48 h時，12.5、50.0 mg/mL表現出葉的酶活力大于莖，而25.0、100.0 mg/mL表現為莖的酶活力大于葉。

2.3 綠薄荷提取物對小菜蛾幼蟲體內GST-s活性的影響

2.3.1 綠薄荷莖提取物對小菜蛾GST-s活性的影響

由表5可知，12 h處理組的酶活力均大于對照，且濃度越大酶活力越高，表明經處理后小菜蛾幼蟲體內的GST-s被激活，濃度越高作用效果越強。24 h時，50.0 mg/mL處理的酶活力略大于對照，其余濃度均為處理組低于對照，表明隨時間增加，綠薄荷莖提取物對小菜蛾產生了毒害作用，對其體內的GST-s開始產生抑制作用。36、48 h的處理組酶活力均低于對照，表明蟲體受綠薄荷莖提取物影響解毒能力減弱，可能是導致其病變、甚至死亡的原因之一。

表5綠薄荷莖提取物對小菜蛾幼蟲體內GST-s活性的影響 U/（mg·min）

2.3.2 綠薄荷葉提取物對小菜蛾GST-s活性的影響

綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內GST-s活性的影響如表6所示。

表6綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內GST-s活性的影響 U/（mg·min）

從表6可以看出，12 h處理組的酶活力均大于對照，表明綠薄荷葉提取物將幼蟲體內的GST-s激活。24 h時，12.5 mg/mL處理的酶活力大于對照，其余濃度均表現出處理組低于對照，表明隨著時間的增加，綠薄荷葉提取物對小菜蛾產生毒害作用，對其體內的GST-s開始產生抑制作用，影響到小菜蛾幼蟲的解毒功能，濃度越高效果越強。36、48 h表現出的處理組酶活力均低于對照，表明綠薄荷葉提取物對蟲體內GST-s酶活性有抑制作用，36 h綠薄荷葉提取物對小菜蛾體內GST-s活性抑制作用最強。

2.3.3 綠薄荷莖和葉提取物對小菜蛾GST-s作用的比較 由圖3可知，12 h時，100.0 mg/mL表現出的酶活力莖大于葉，其他濃度條件下均表現出葉的酶活力強于莖；24 h時，12.5、25.0、100.0 mg/mL的綠薄荷葉提取物的GST-s活力高于莖，50.0 mg/mL表現出莖大于葉；36 h時，100.0 mg/mL表現出葉的酶活力大于莖，其他濃度條件下均表現出莖的酶活力強于葉；48 h時，12.5、50.0 mg/mL的綠薄荷葉提取物對小菜蛾幼蟲體內的GST-s活力高于莖，而25.0、100.0 mg/mL時莖的酶活力大于葉。

3 結論與討論

昆蟲在長期的進化過程中，逐漸在體內形成了具有代謝分解外來有毒物質的解毒代謝系統，其中重要的酶主要有乙酰膽堿酯酶（AchE）、羧酸酯酶（CarE）和谷胱甘肽-S-轉移酶（GST-s）[27-28，35]。AchE通過催化神經遞質乙酰膽堿的水解來阻止神經沖動，而CarE和GST可以增加昆蟲對外源性化合物的代謝活性，從而發揮排毒作用。

研究發現，花椒（Zanthoxylum bungeanumMaxim.）、野艾蒿（Artemisia lavandulaefoliaDC.）及艾蒿（Artemisia argyiH.）等植物提取物對小菜蛾體內AchE呈抑制作用[36]。苦豆子植物的生物堿對小菜蛾體內的CarE活力具有一定的影響[37]。野艾蒿提取物對小菜蛾體內GST-s活性也呈現抑制作用[38]。GAO等[39]的研究表明，經韭菜精油處理小菜蛾幼蟲后，其體內GST活性降低，正常排毒代謝受到損害；CarE活性低于對照幼蟲；而AchE活性是對照幼蟲AchE活性的2倍。WEI等[40]研究發現，使用土荊芥精油的接觸毒性劑量處理小菜蛾幼蟲后，CarE和GST的活性被顯著抑制。

小菜蛾在取食有毒害植物時，體內的酶活性也會發生變化。為了研究毒殺作用的機制，本試驗研究了3種酶的活性，結果表明，經處理后的小菜蛾體內AchE、CarE、GST-s活力均為先激活后抑制，處理組的酶活力顯著低于對照，提取物濃度越高酶活力越低。表明綠薄荷莖、葉提取物作用于小菜蛾蟲體后，解毒酶系的活力先被激活，適應和緩解有毒物質的作用，隨著作用時間增加，酶活力降低，對毒害物質的代謝能力隨之下降，最終致其死亡。這可能是由于小菜蛾體內產生了抑制解毒酶的物質或者是直接抑制了小菜蛾的解毒酶活性。有報道顯示，不同濃度飛機草（Eupatorium odoratumL.）根、莖、葉提取物對美國白蛾（Hyphantria cunea（Drury））幼蟲體內的解毒酶（CarE、AchE、GST-s）抑制作用也呈現出此趨勢。隨著時間的延長和綠薄荷提取物濃度的增加，小菜蛾體內解毒酶酶活逐漸降低，直至死亡。本研究與土荊芥（Chenopodium ambrosioidesL.）精油對小菜蛾幼蟲體內的CarE活力影響規律一致[41]。前人對植物提取物相關的研究，均以莖葉混合提取，本研究分別對莖和葉的乙醇提取物的作用效果進行比較，且綠薄荷葉提取物對小菜蛾體內解毒酶的抑制作用比莖強[42-43]。

本研究通過用不同濃度的綠薄荷莖葉提取物喂食小菜蛾3齡幼蟲，測定蟲體內主要的解毒酶活性。結果顯示，莖、葉提取物對小菜蛾解毒酶系的作用均為先激活后抑制，隨著時間的延長，小菜蛾出現死亡現象，這可能與體內的這幾種解毒酶受抑制有關。