外源NO對鎘脅迫下大豆幼苗生理特性的影響

楊玉花，白志元，張瑞軍，衛保國

（山西農業大學農業基因資源研究中心（山西省農業科學院農作物品種資源研究所），山西太原030031）

鎘是植物體內的非必需元素，有轉移快、難降解、毒性大的特點。隨著我國城市化和工業化的進行，工業廢水、廢渣攜帶大量鎘離子滲透入土壤中。同時純度不高的農藥和化肥中都有鎘離子的殘留，無節制的施用均導致了農田土壤中鎘含量急劇增加。據統計，我國受鎘元素等重金屬污染的農業用地將近2 000萬hm2，約占全國農業用地總面積的20% 。耕地中鎘元素的不斷增加，已經成為影響我國農作物生產及食品安全的重要隱患。趙毅等[1]研究發現，鎘脅迫下，大豆幼苗根和葉的生長受到了嚴重抑制；邱志勇[2]研究表明，鎘脅迫會降低大豆幼苗的光合色素含量，對光合作用產生嚴重阻礙；劉強等[3]研究發現，鎘離子可使煙草細胞內產生大量O2-和H2O2等活性氧，從而損傷植物細胞，產生鎘脅迫反應。

一氧化氮（NO）是植物體內重要的信號分子，能夠調控植物體內多個生長途徑和不同途徑中多個基因的表達。目前已經證實的通路包括NO合成酶途徑、硝酸還原酶、亞硝酸還原酶途徑，并且這些途徑廣泛參與到其他信號通路[4-5]。李莉等[6-7]研究表明，適宜濃度的外源NO可以有效提高幼苗根長和莖長，增加植物體內光合色素的含量，增強植物的光合作用。馬曉麗等[8]研究表明，在鎘脅迫下，NO可以通過提高抗氧化酶的活性來減弱鎘離子脅迫對小麥產生的負作用。近年來，隨著鎘污染情況越來越嚴重，科研工作者進行了大量關于緩解植物鎘脅迫的研究。然而，關于外源NO對鎘脅迫下大豆生理影響的研究鮮見報道。

本研究開展了外源NO緩解大豆幼苗鎘脅迫的效應試驗，通過測定大豆幼苗期生理指標，研究可緩解大豆鎘脅迫的最適硝普鈉（SNP）濃度，以期為鎘污染防治和土壤修復提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試大豆品種為晉豆48號，是山西省農業科學院農作物品種資源研究所雜交大豆課題組于2014年通過山西省農作物品種委員會審定的一個大豆雜交種。

鎘離子供體為Cd（NO3）2，購自山西飛達生物科技有限公司。NO供體為Na2［Fe（CN）5NO］·2H2O（硝普鈉，SNP），購自山西飛達生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子萌發 選取均勻無病害的晉豆48號大豆種子，用滅菌水在室溫下浸泡6～8 h。然后用75% 乙醇沖洗30 s，15% 的NaClO沖洗20 min，滅菌水洗滌3次，放入真空干燥箱40℃烘干1 h。試驗設CK（處理液為滅菌水）和6個處理組，6個處理組中均添加0.5 mmol/L的Cd（NO3）2，pH值控制在5.4，并分別添加濃度為0、50、100、150、200、300μmol/L SNP溶液，分別命名為NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300。將大豆種子置于9 cm培養皿中的濾紙上，濾紙用不同濃度的SNP溶液處理，每個處理3次重復，每個重復30粒種子。大豆種子于25℃培養箱中培養，避光催芽3 d，在光照/黑暗12 h/12 h、相對濕度70% 下進行培養，此后每天以滅菌水補充蒸發掉的液體。

1.2.2 大豆幼苗形態指標的測量 將1.2.1培養7 d后的晉豆48號大豆幼苗進行莖長、根長等形態指標的測定。

1.2.3 大豆幼苗生理指標的測定 將1.2.1培養10 d后的晉豆48號大豆幼苗進行各項生理指標的測定。

葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量的測定：避光條件下在丙酮∶乙醇為1∶1（V/V）的溶液中磨碎晉豆48號大豆幼苗葉片，然后分別在470、649、665 nm波長下測定吸光度值。

SOD、POD和CAT活性采用彭艷等[9]的方法測定；APX活性采用陳海霞等[10]的方法測定；根尖O2-和H2O2含量采用ZHOU等[11]的方法，取根尖1 cm測定。

1.3 數據處理

試驗采用Excel整理數據和作圖，采用SAS v8軟件分析數據。

2 結果與分析

2.1 外源NO對鎘脅迫下大豆幼苗形態指標的影響

由圖1可知，6個添加了鎘離子的處理NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300在7 d的根長和莖長均顯著短于未添加鎘離子的CK，根長較CK分別降低79.08% 、55.60% 、31.75% 、59.52% 、67.56% 和75.64% ；莖長較CK分別降低74.49% 、59.70% 、39.15% 、55.69% 、69.41% 和76.95% 。說明鎘脅迫對大豆的根長和莖長有較強的抑制作用。在存在鎘脅迫的6個處理中，添加了SNP的NO-50、NO-100、NO-150、NO-200處理的根長和莖長均大于未添加SNP的NO-0處理，根長較NO-0處理增幅分別為112.30% 、226.32% 、93.56% 和55.08% ；莖長較NO-0處理增幅分別為57.96% 、138.49% 、73.66% 和19.89% 。說明SNP可有效緩解鎘離子脅迫對大豆根長和莖長的影響。其中，SNP濃度為100μmol/L的處理NO-100的根長和莖長最長，分別為7.6、7.39 cm。NO-300處理的大豆莖長小于NO-0處理，降幅為9.68% ，說明較高的SNP濃度反而會降低其緩解鎘脅迫的作用。

2.2 外源NO對鎘脅迫下大豆幼苗葉片光合色素含量的影響

從圖2可以看出，在鎘脅迫下的NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理在葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量上均顯著少于未添加鎘離子的CK，葉綠素a較CK分別降低47.02% 、31.42% 、17.76% 、38.04% 、43.50% 、48.59% ，葉綠素b較CK分別降低49.88% 、23.25% 、16.00% 、27.75% 、49.13% 、57.25% ，類胡蘿卜素較CK分別降低56.45% 、30.49% 、18.02% 、41.79% 、53.36% 、61.22% 。說明鎘脅迫對大豆葉片的光合色素含量有較強的抑制作用。在相同濃度的鎘離子脅迫下，施加SNP的濃度為100μmol/L時，大豆幼苗葉片的葉綠素a、b和類胡蘿卜素含量有顯著提高；其中，與未添加SNP處理NO-0相比，葉綠素a含量增加54.97% ，葉綠素b含量升高47.33% ，類胡蘿卜素含量升高86.73% 。NO-300處理的大豆幼苗葉片各色素含量均顯著下降，說明這個濃度的SNP對大豆的光合作用產生了抑制作用。

2.3 外源NO對鎘脅迫下大豆幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖3可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的SOD活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，較CK分別降低33.12% 、24.44% 、10.29% 、25.06% 、32.19% 和45.59% ，說明鎘離子對大豆體內的SOD活性有較強的抑制作用。在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對大豆葉片中的SOD活性有顯著影響，其中，NO-50、NO-100、NO-150處理較NO-0處理的SOD活性均有提高，增幅分別為12.97% 、34.13% 、12.04% 。NO-300處理的SOD活性較NO-0處理有較大的下降，降幅為18.64% ，說明較大濃度的SNP會造成SOD活性的降低。

由圖4可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的CAT活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，降幅分別為49.20% 、38.67% 、7.09% 、26.65% 、34.48% 、47.34% 。且在鎘脅迫下，不同濃度SNP對大豆葉片中的CAT活性有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的CAT活性較NO-0處理均有不同程度增加，增幅分別為25.91% 、90.76% 、50.61% 、34.53% 和8.13% 。

由圖5可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的POD活性均不同程度低于未處于鎘脅迫的CK，降幅分別為30.80% 、11.03% 、4.48% 、16.09% 、27.93% 和39.54% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對大豆葉片中的POD活性有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200處理的POD活性較NO-0處理均有增加，增幅分別為28.36% 、37.81% 、21.06% 、3.98% 。

由圖6可知，鎘脅迫下，NO-0處理大豆葉片APX活性較CK有顯著下降，降幅為41.61% ，說明鎘脅迫對大豆葉片中APX活性有明顯的抑制作用。處于鎘脅迫下的NO-100處理的APX活性不僅高于NO-0處理，同時還顯著高于未添加鎘離子的CK，較CK增加28.36% 。說明適量的SNP不僅可以抵消鎘脅迫對大豆葉片中APX活性的影響，還可以大幅提升APX活性。NO-50、NO-150、NO-200處理的APX活性，均顯著高于未添加SNP的NO-0處理，同時較CK下降不明顯，較CK分別下降8.49% 、2.07% 和22.98% 。

由圖7可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的葉片O2-產生速率均不同程度高于未處于鎘脅迫的CK，增幅分別為81.14% 、57.89% 、22.38% 、42.73% 、51.14% 和71.49% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對大豆根部中的O2-產生速率有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300處理的O2-產生速率較NO-0處理均有不同程度降低，降幅分別為12.83% 、32.44% 、21.20% 、16.56% 和5.32% 。

由圖8可知，NO-0、NO-50、NO-100、NO-150、NO-200、NO-300處理的葉片H2O2含量均不同程度高于未處于鎘脅迫的CK，增幅分別為58.03% 、41.32% 、10.21% 、25.23% 、34.88% 和51.36% 。且在鎘脅迫下，不同濃度的SNP對大豆根部中的H2O2含量有顯著影響。NO-50、NO-100、NO-150、NO-200和NO-300處理的H2O2含量較NO-0處理均有不同程度的降低，降幅分別為10.57% 、30.26% 、20.75% 、14.64% 和4.22% 。

3 結論與討論

鎘是大豆體內的非必需元素，會對大豆的正常生長起到抑制作用，降低大豆的產量和品質[12]。鎘離子可損害大豆的根系，降低主根的生長長度和側根數量，甚至會造成根部的畸形壞死[13]。同時鎘離子也會破壞大豆的光合系統，降低葉綠素、類胡蘿卜素的含量，抑制光合作用[14]。NO是廣泛存在于植物體內的重要信號分子[15]。陳秀蘭等[16]研究表明，在鎘脅迫下施用外源NO可以有效緩解鎘離子對水稻根的影響。張茜等[17]在棉花上的研究表明，適量的外源NO可增加植物體內葉綠素的含量，增加葉綠素相關基因的表達量，從而增強植物的光合作用。

本研究結果表明，較高濃度的鎘脅迫對大豆幼苗根長、莖長產生明顯的抑制作用。而適當濃度的外源NO可以有效減弱鎘脅迫對大豆幼苗根長、莖長產生的副作用。這與于肇端等[18]在黃瓜上、巴青松等[19]在小麥上、李燕歌[20]在甜茶上的研究結果相一致。本研究發現，較高濃度鎘離子會嚴重損害大豆的光合系統，而添加100μmol/L SNP可以有效緩解鎘脅迫，提高植物光合色素的含量，改善其大豆葉片的光合作用。一方面可能是因為信號分子NO提高了類囊體膜蛋白的穩定性，從而降低了鎘脅迫對類囊體膜的破壞作用；另一方面可能是由于NO激活了大豆葉片中的葉綠素表達基因，從而提高了光合色素的含量[15]。大量研究表明[21-22]，鎘脅迫會導致植物體內積累大量氧的自由基，造成植物細胞膜過氧化，從而引起一系列的生理紊亂。在較低濃度的鎘脅迫環境下，植物通過提高自身POD、SOD、CAT等保護酶活性和APX等抗氧化物酶活性，來維持體內氧的自由基產生和消耗的動態平衡。但是高濃度的鎘離子會占據或替換保護酶和抗氧化物酶的活性中心，從而降低酶活性，無法行使正常功能，進而影響種子萌發、幼苗生長和光合作用[23-25]。本研究表明，在鎘脅迫下大豆幼苗葉片中的POD、SOD、CAT和APX活性顯著下降，根尖的O2-產生速率和H2O2含量顯著上升，而通過加入100μmol/L SNP可有效提高大豆幼苗葉片中的保護酶和抗氧化物酶活性，降低活性氧的含量。

本研究以在高濃度鎘脅迫下的晉豆48號為材料，探究了不同濃度SNP對大豆幼苗各項生理指標的影響。結果表明，適宜濃度的外源NO可以促進大豆種子萌發，增加葉片中光合色素含量，提高POD、SOD、CAT和APX活性，降低根尖的O2-產生速率和H2O2含量，從而有效緩解鎘脅迫對大豆造成的傷害。