綠洲一號(hào)菌草組培快繁技術(shù)體系的建立

解曉紅，解紅娥，王凌云，李江輝，吳宇浩，王 萌，張鴻興，武宗信

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院）棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

綠洲一號(hào)菌草是單子葉禾本科蘆竹屬植物，為多年生叢生草本植物，是一種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌草，廣泛分布于溫帶、亞熱帶、熱帶等氣候溫暖區(qū)域。該菌草不僅植株高大、莖干直立挺拔、葉片寬大鮮綠、根系茂密發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)、營養(yǎng)豐富、粗蛋白和糖分含量高、單位面積產(chǎn)量高，而且用途極廣，是治理水土流失、防風(fēng)固沙、畜牧養(yǎng)殖的優(yōu)良草種，還是優(yōu)質(zhì)密度板、可紡原纖維、造紙、造肥的原材料以及食藥用菌栽培的優(yōu)質(zhì)培養(yǎng)料；此外，還可作為生物質(zhì)燃料燃燒發(fā)電，生產(chǎn)燃料乙醇等[1-4]。目前，菌草技術(shù)已在我國30個(gè)省、市、自治區(qū)推廣應(yīng)用，并傳播到全球101個(gè)國家，菌草已成為許多地方實(shí)施農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新提檔升級(jí)行動(dòng)的重點(diǎn)項(xiàng)目，成為扶貧產(chǎn)業(yè)和生態(tài)產(chǎn)業(yè)，進(jìn)而融入“一帶一路”發(fā)展戰(zhàn)略。

綠洲一號(hào)菌草目前的市場應(yīng)用前景非常廣闊，在新疆、福建等地用于沙漠治理、畜牧業(yè)養(yǎng)殖和食用菌種植等方面需求量很大，每年需種苗上億株。但綠洲一號(hào)無法通過種子進(jìn)行有性繁殖，且通過壓條、扦插等方式進(jìn)行無性繁殖的成活率也不高（20% 左右），其大面積推廣應(yīng)用受到限制。而組織培養(yǎng)快繁技術(shù)是在保證原有品種特性的基礎(chǔ)上，使其呈現(xiàn)幾何倍數(shù)增長的繁殖系數(shù)，及時(shí)快速提供規(guī)模整齊一致的優(yōu)質(zhì)苗木[5]，是解決綠洲一號(hào)菌草快速繁育的有效手段。

本研究對綠洲一號(hào)組培高效快繁技術(shù)進(jìn)行研究，旨在為綠洲一號(hào)種苗產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

供試綠洲一號(hào)菌草樣本采自山西省運(yùn)城市綠碧源農(nóng)林開發(fā)有限公司菌草種植基地，選取無病蟲害侵染且生長旺盛的綠洲一號(hào)菌草植株。

1.2 方法

1.2.1 外植體消毒 選取生長健壯的綠洲一號(hào)未伸展的幼嫩莖段的側(cè)芽（圖1），先用自來水沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上切去幼嫩側(cè)芽（基部帶少量莖節(jié)組織）放于無菌瓶中，用75% 乙醇消毒30 s，再用0.1% HgCl2消毒6～8 min，用無菌水沖洗5～6次。

1.2.2 初代培養(yǎng) 將分割好的帶有一個(gè)腋芽的無菌幼嫩莖段接種到MS附加不同植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中（表1），每瓶接種3個(gè)幼莖段，每個(gè)處理30瓶，30 d統(tǒng)計(jì)分化結(jié)果。

1.2.3 繼代培養(yǎng) 將生長較高且有明顯分節(jié)的苗子切成單個(gè)帶芽節(jié)段繼代，每個(gè)帶芽節(jié)段作為一個(gè)外植體；然后，再用刀片經(jīng)過叢生節(jié)點(diǎn)縱向分割叢生苗，平放接種到MS附加有不同植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中（表2）誘導(dǎo)叢生苗，30 d統(tǒng)計(jì)增殖結(jié)果。

1.2.4 組培苗生根培養(yǎng) 切取小芽苗，接種到MS附加有不同植物生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基中（表3）進(jìn)行生根誘導(dǎo)，每瓶接種4個(gè)芽苗，每個(gè)處理20瓶，30 d統(tǒng)計(jì)生根結(jié)果。

1.2.5 培養(yǎng)基條件 本試驗(yàn)中，蔗糖30 g/L，瓊脂6.7g/L，pH值為5.8～6.0，光照強(qiáng)度為2 000～5 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d，培養(yǎng)溫度為（28±1）℃。

1.2.6 組培苗移栽 待實(shí)驗(yàn)室組培苗長至6～8 cm時(shí)進(jìn)行移栽，20 d統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同生長調(diào)節(jié)劑對初代培養(yǎng)芽分化的影響

切取分割好的帶有一個(gè)腋芽（基部帶有少量莖節(jié)組織）的無菌幼嫩莖段接種到以MS＋3.0 mg/L 6-BA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑培養(yǎng)基上，結(jié)果表明（表1），IBA、NAA均能促進(jìn)菌草幼嫩莖腋芽分化，在誘導(dǎo)分化過程中IBA效果優(yōu)于NAA；隨著IBA、NAA濃度的增加，芽分化呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；同時(shí)，隨濃度增加芽生長勢漸弱。以MS＋3.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L IBA的誘導(dǎo)效果最好，在此培養(yǎng)基上，平均可分化2.64個(gè)幼芽（苗），分化的叢生幼芽和分蘗苗健壯均勻，生長快。

表1不同生長調(diào)節(jié)劑對芽分化的影響

2.2 不同生長調(diào)節(jié)劑對繼代增殖培養(yǎng)的影響

將初代培養(yǎng)形成的分蘗苗或叢生幼芽過叢生節(jié)點(diǎn)縱向分割，平放接種到MS附加有不同濃度的6-BA、IBA培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖，結(jié)果表明（表2），綠洲一號(hào)菌草幼芽接種在9種不同增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，增殖系數(shù)和生長狀況差異較大，其中，在J4、J5、J6培養(yǎng)基中增殖系數(shù)較大，分別達(dá)到5.63、6.12、4.97；在其余培養(yǎng)基中增殖系數(shù)均較低；J5培養(yǎng)基形成的幼芽（苗）密集、健壯，生長勢強(qiáng)，平均增殖系數(shù)達(dá)6.12，為綠洲一號(hào)菌草組培繼代增殖的最佳培養(yǎng)基配方（圖2、3）。

表2不同生長調(diào)節(jié)劑對菌草繼代增殖的影響

2.3 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對菌草生根的影響

表3不同植物生長調(diào)節(jié)劑對生根的影響

綠洲一號(hào)組培苗在繼代增殖培養(yǎng)的同時(shí)，同步生根，為了提高生根數(shù)量及質(zhì)量，添加了不同生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行培養(yǎng)。由表3可知，MS＋0.1～1.0 mg/L NAA及2.0～7.0 mg/L IBA均能促進(jìn)幼苗生根；從生根數(shù)量和根長上分析，IBA誘導(dǎo)生根的效果優(yōu)于NAA，其中，5.0 mg/L IBA生根效果最好，平均根數(shù)達(dá)11.75條，根細(xì)而密，有韌性，移栽成活率高；而NAA誘導(dǎo)出的根系少、粗短、脆性大（圖4、5）。

2.4 組培苗移栽情況

組培苗根系良好，葉片舒展，葉色濃綠，苗莖深綠，株高長至6～8 cm的組培苗即可移栽；移栽時(shí)取出小苗，用清水沖洗干凈殘留在根上的培養(yǎng)基，移栽至經(jīng)高錳酸鉀消毒過的苗床中，淋透水，使苗床土壤含水量達(dá)到13% ～14% ，加蓋塑料薄膜拱棚及黑網(wǎng)（1/2透光），避免陽光直射；移栽3 d后，在薄膜上打孔透氣，以薄膜上沒有水滴為適宜打孔密度；10 d后揭膜，期間每隔5 d交替噴施殺菌劑及葉面肥（0.05% 的尿素＋0.05% 磷酸二氫鉀）或可溶性復(fù)合肥（0.1% ）一次，20 d移栽成活率達(dá)96% 以上。

3 結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)技術(shù)能以幾何倍數(shù)快速繁殖其后代，對一些繁殖系數(shù)低、不能用種子繁殖的名特優(yōu)植物品種的繁殖意義尤為重大[5-6]。國內(nèi)研究者針對利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)繁殖植物品種已進(jìn)行大量的研究，在多種植物上取得了成功，并已應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[7-12]。而植物組織培養(yǎng)中，生長調(diào)節(jié)劑是影響植物分生組織再生能力的關(guān)鍵物質(zhì)，在不同分生組織誘導(dǎo)叢生芽分化、繼代增殖、生根培養(yǎng)等方面起著重要的調(diào)節(jié)作用，有關(guān)生長調(diào)節(jié)劑對植物分生組織再生能力的影響已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[13-22]；一種植物再生體系的建立，依賴于篩選到合適的生長調(diào)節(jié)劑及其配比，主要靠調(diào)節(jié)生長素和細(xì)胞分裂素的濃度和比例來實(shí)現(xiàn)，生長素比例高有利于細(xì)胞分裂（脫分化形成愈傷，促進(jìn)幼苗形成、生長和生根等）、分裂素比例高有利于分化（形成叢生芽、不定芽和幼苗等）。本研究篩選到適宜綠洲一號(hào)菌草的初代培養(yǎng)、繼代增殖和生根培養(yǎng)基，成功建立了綠洲一號(hào)菌草的組培快繁技術(shù)體系。綠洲一號(hào)菌草幼莖側(cè)芽在MS＋3.0 mg/L 6-BA＋0.2 mg/L 2，4-D＋1.0 mg/L IBA培養(yǎng)基中進(jìn)行初代培養(yǎng)，分化的叢生苗和分蘗苗健壯均勻，可平均分化2.64個(gè)幼芽（苗）；最佳繼代增殖培養(yǎng)基為MS＋5.0 mg/L 6-BA＋1.0 mg/L IBA，增殖系數(shù)達(dá)到6.12，增殖的幼芽密集、健壯，生長勢強(qiáng)；最佳生根培養(yǎng)基為MS＋5.0 mg/L IBA，小芽苗在此培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，平均根數(shù)為11.75條，根長為3.33 cm，根細(xì)而密，有韌性。IBA對綠洲一號(hào)菌草幼芽的生長、發(fā)育和生根培養(yǎng)的效果優(yōu)于NAA；適宜濃度的6-BA可明顯促進(jìn)叢生芽的分化和增殖。

一般情況下，2，4-D在組培中具有優(yōu)良的愈傷和脫分化功能，通過愈傷分化叢生芽或幼苗能極大增大繁殖系數(shù)。本研究中，只添加了一個(gè)濃度的2，4-D直接誘導(dǎo)出了叢生芽和分蘗苗進(jìn)行繁殖，沒有經(jīng)過誘導(dǎo)愈傷組織，通過誘導(dǎo)愈傷組織進(jìn)一步分化成苗或叢生芽的體系還有待進(jìn)一步研究。另外，在繼代過程中，對待繼代的叢生芽的分割，要將生長較高且有明顯分節(jié)的幼苗切成單個(gè)帶芽節(jié)段繼代，莖段芽在適宜培養(yǎng)基上可以繼續(xù)分化出叢生芽。縱向分割叢生苗時(shí)，必須經(jīng)過叢生節(jié)點(diǎn)，切除根部組織，平放接種于培養(yǎng)基上，在繼代時(shí)仍能從分割的節(jié)點(diǎn)上繼續(xù)長出叢生芽，這樣均有利于繁殖系數(shù)的提高和外植體快速增殖；否則叢生芽不會(huì)增殖，而是直接長成幼苗。

綠洲一號(hào)菌草是我國在國際上唯一擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的植物，應(yīng)用范圍廣，利用價(jià)值大，每年市場需求種苗達(dá)上億株。本研究采用綠洲一號(hào)菌草未伸展的幼嫩莖段的側(cè)芽誘導(dǎo)完整植株的方法，不受季節(jié)和外界環(huán)境的影響，可在短時(shí)間內(nèi)培育出大量規(guī)模整齊一致的菌草苗木，為綠洲一號(hào)菌草苗木的工廠化生產(chǎn)和產(chǎn)業(yè)的規(guī)模化發(fā)展提供了技術(shù)支撐。