流式細胞術鑒定蘋果花藥培養再生植株倍性的方法

鄧 舒，張春芬，肖 蓉，曹秋芬

（1.山西農業大學果樹研究所，山西太原030031；2.山西農業大學生命科學學院，山西太原030031）

蘋果栽培歷史悠久，是世界重要的栽培果樹之一。目前蘋果育種主要采用常規雜交育種。由于其高度雜合的基因型以及自交不親和現象的存在，蘋果純合系的獲得很困難，育種周期長，效率低。而利用生殖細胞培養誘導形成植株，是獲得純合基因型植株的重要方法[1]。

蘋果花藥培養獲得的純合基因型植株來源于不同的花粉，這些小孢子來源的單倍體植株生存困難，多數植株在生長過程中會發生加倍現象，生成純合二倍體、三倍體、四倍體甚至非整倍體植株；但也有一部分小孢子仍然維持原來的倍性，形成單倍體植株[1]。由于基因組的不同倍性對植株的性狀、育性等方面都有重要的影響。因此，對花藥離體培養獲得的植株進行倍性鑒定，是研究蘋果純合新種質，進行育種與遺傳分析的必要手段之一。

傳統的倍性鑒定主要采用根尖壓片與染色體計數法。這種方法雖然直觀、精確、可靠，但操作復雜，對技術要求也較高，耗時耗力，不適宜進行快速、批量的鑒定。流式細胞術是對處在液流中的微粒進行快速分析和分選的技術。利用流式細胞術可以準確地檢測細胞中DNA含量，進而通過與對照植株的DNA含量對比，確定待測植株的倍性。其是一種簡單、快速的植物倍性鑒定方法[2-3]。近些年，利用流式細胞儀檢測植物倍性的技術已經在梨、蘋果、草莓、獼猴桃、棗、山楂、石榴等果樹中得到了應用[4-12]。植物細胞往往含有次生代謝物，同一種解離液在不同物種不同組織的效果并不相同，沒有植物上普遍適用的解離液。

本研究針對蘋果花藥再生純合植株，對試驗中的關鍵因素——解離液的配方進行探索，通過對4種解離液的試驗結果進行比較分析，選出適宜的解離液，建立利用流式細胞術鑒定蘋果花藥再生植株倍性的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為嘎啦蘋果花藥培養獲得的純合體組培苗。

1.2 試驗設計

試驗共設置4種解離液。（1）LB01 lysis解離液。15 mmol/L Tris；2 mmol/L EDTANa2；0.5 mmol/L四鹽 酸 精 胺；80 mmol/L KCl；20 mmol/L NaCl；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，加入15 mmol/Lβ-巰基乙醇，于-20℃貯藏。（2）Galbraith's解離液。45 mmol/L MgCl2；20 mmol/L MOPS；30 mmol/L檸檬酸鈉；0.1% （V/V）Triton X-100；pH值7.0。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，于-20℃保存。（3）Tris-MgCl2解離液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；0.5% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，于4℃貯藏。（4）WPB解離液。200 mmol/L Tris；4 mmol/L MgCl2；2 mmol/L EDTANa2；86 mmol/L NaCl；10 mmol/L焦亞硫酸鈉，1% PVP-10；1% （V/V）Triton X-100；pH值7.5。通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，于4℃保存。

試驗中有2種貯藏液，第1種為PI貯藏液，將PI粉末溶入水中，終濃度為1 mg/mL，通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，-20℃保存；第2種為RNase貯藏液，將RNase粉末溶入水中，終濃度為1 mg/mL，加熱煮沸15 min，除去DNase，通過0.22μm的過濾器過濾除去雜質，-20℃保存。

1.3 細胞核懸液制備

細胞核懸液按照文獻[2]的方法進行。將蘋果組培苗葉片放入培養皿中，加入1 mL預冷的提取液，在液體中用鋒利的刀片快速對葉片進行切割，然后在冰上放置1 min，用移液槍混勻幾次，通過0.037 mm尼龍篩網過濾，保留過濾液（約500μL）。將過濾液放入離心機1 000 r/min，4℃，離心5 min。棄上清后，加入200μL預冷的解離液，再加入10μL PI貯藏溶液和10μL RNase貯藏溶液，輕柔混勻。同時另設一組處理，過濾液不經過離心，直接加入20μL PI貯藏溶液和20μL RNase貯藏溶液，輕柔混勻。制備好的細胞核懸液冰上放置15 min，上機檢測。

1.4 流式細胞分析

試驗所用流式細胞儀為BD公司的Accuri_C6流式細胞儀。采用488 nm紫外激光光源，采集通道為FL-2。樣品流速設定為慢速（12μL/min）。每個樣品采集5 000個顆粒進行DNA含量分析。

2 結果與分析

從蘋果花藥培養獲得的再生植株中，取已知倍性的單倍體植株與二倍體植株各1株，分別采集其葉片，利用4種解離液制備的細胞核懸液進行染色，然后分別上機進行DNA含量檢測與倍性分析。結果表明，不同的解離液處理后，檢測所形成的峰的形狀和雜帶的大小均有區別。

LB01 lysis解離液檢測結果表明（圖1），單倍體和二倍體再生植株均可以獲得較清晰的主峰，但單倍體的雜峰相對較多。

Galbraith's解離液的檢測結果表明（圖2），無論 單倍體還是二倍體均主峰明顯，雜峰少。

Tris-MgCl2解離液的檢測結果表明（圖3），二倍體主峰不明顯，峰值不高；單倍體雖能分辨出主峰，但峰形差，雜峰高。

WPB解離液的檢測結果表明（圖4），無論單倍 體還是二倍體，其主峰高且明顯，雜峰低，峰形較好。

在單倍體和二倍體植株中，利用LB01 lysis、Galbraith's、WPB這3種解離液解離蘋果的葉片細胞均能夠檢測蘋果葉片細胞的DNA含量、分出DNA的主峰，但WPB的峰更高、更明顯，且雜峰更小，表明WPB是最適宜蘋果花藥培養再生植株倍性鑒定的解離液，Galbraith's和LB01 lysis次之，而Tris-MgCl2不適合蘋果再生植株的倍性鑒定。

對4種解離液細胞核懸浮液離心處理的試驗結果表明，離心后顆粒信號收集慢，雖然降低了雜峰，但是主峰也相應減小、不明顯。檢測結果沒有未經離心的懸浮細胞核效果好。因此，細胞核懸浮液不進行離心，染色后直接上機檢測為宜。

3 結論與討論

隨著植物倍性的增加，細胞中染色體的總數增加，DNA含量增加，經PI染色后，熒光強度也隨之增強。通過流式細胞儀采集鑒定，測量出細胞中DNA含量的高低，再通過與已知倍性的標準植株對比，計算出待測植株的倍性。

不同的植物細胞含有的次生代謝物種類和含量不同，適宜的解離液也不同。如果解離液不適宜，會影響細胞核的游離和懸浮，無法獲得準確的倍性結果或無結果。本研究對4種解離液進行了試驗，旨在選出利用流式細胞儀鑒定蘋果純合植株的最適宜解離液和檢測方法。結果表明，WPB為蘋果花藥培養再生植株倍性鑒定的最適宜解離液。

單寧酸是一種常見的酚類化合物，經常積累在植物，尤其是木本植物的各種組織中。有文獻指出，植物細胞中的單寧酸對解離液會產生負面影響[13-16]。許多木本果樹中，WPB解離液都表現出很好的適應性[17]。WPB由Tris-MgCl2優化而來，是單寧酸影響作用最小的解離液[18]。WPB除了含有螯合劑和無機鹽之外，還含有1% 的Triton X-100，在所有文獻報道的解離液中含量最高[19-20]。Triton X-100起到解離細胞、釋放細胞核、減少核黏連的作用。PVP有助于消除酚類等黏性物質，再加上焦亞硫酸鈉這種還原劑，能夠防止次生代謝物質的氧化，使得WPB適合于對木本植物組織的細胞進行解離與倍性分析[17]。本研究中，可能是因為蘋果組培苗葉片中單寧含量較少，Galbraith's、LB01 lysis雖然不及WPB的解離效果好，但仍然可以應用于蘋果再生植株的組培苗倍性鑒定。此外，制備的細胞懸浮液不經離心，直接染色后上機檢測，更適合蘋果組培再生植株的檢測。