抑制血清應答因子表達影響轉化生長因子β1 介導的食管癌上皮細胞-間質轉化的作用研究

何喜，王志強，林韜，胡萬寧，張明明

作者單位：唐山市人民醫院胸外科，河北 唐山063001

上皮間質轉化（epithelial interstitial transformation，EMT）在腫瘤的發生、發展中起到了重要的調節作用，與腫瘤的增殖、遷移和侵襲，復發和預后不良關系密切，也是腫瘤放化療耐藥的重要因素［1］。體內外研究均發現，EMT的發生多提示食管癌預后不良，促進腫瘤進展，使食管癌細胞遷移和侵襲能力增加［2-3］。研究表明，血清應答因子（serum response factor，SRF）在腫瘤中的高表達與EMT關系密切，其作為轉錄因子能夠下調E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達［4］，同時亦能夠調節下游靶蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表達并促進EMT 的形成［5］。本課題組前期研究也發現，SRF 在食管癌組織中的異常高表達，采用基因沉默方法降低SRF的表達，則能夠有效的在體外抑制食管癌細胞的增殖［6］。因此本研究于2019年1—12月擬采用轉化生長因子β1（transforming growth factorβ1，TGF-β1）在體外誘導Eca-109 食管癌細胞發生EMT，并觀察基因沉默SRF 對其的干預效應，為開發食管癌新的基因治療提供初步的實驗依據。

1 材料與方法

1.1主要試劑Eca-109食管癌細胞購置于中科院上海細胞庫；DMEM 培養基、胎牛血清購置于美國GIBIO 公司；TGF-β1 購置于美國 peprotech 公司；SRF、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、GAPDH購置于美國santa cruz 公司；α-SMA 購置于英國abcam 公司；小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）產品購置于廣州銳博生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 細胞培養及轉染 Eca-109 細胞用含體積分數為10%胎牛血清的1640 培養基，置于37 ℃，5%二氧化碳孵育箱中培養。待細胞次融合狀態后，實驗分組為：（1）陰性對照siRNA 組：陰性對照siRNA轉染6 h，更換無血清培養基24 h；（2）TGF-β1+陰性對照siRNA 組：陰性對照siRNA 轉染6 h，更換含5 ng/mL TGF-β1 誘導 24 h；（3）TGF-β1+SRF-siRNA組：SRF-siRNA 轉染6 h 后，更換含5 ng/mL TGF-β1誘導+SRF-siRNA。按照轉染手冊步驟進行，每25平方厘米細胞培養瓶加入50 nmol/mL 脂質體轉染試劑和10 μL siRNA 陰性對照或SRF-siRNA。siRNA陰性對照序列：正向序列：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′ ，反 向 序 列 ：5′ -ACGUGACACGUUCGGA GAATT-3′；SRF-siRNA 序列：正向序列：5′-GCAAGGCACUGAUUCAGACTT-3′，反向序列：5′-GUCUGAAUCAGUGCCU UGCTT-3［6］。

1.2.2 細胞劃痕實驗 將Eca-109 細胞按照6000個/孔種植于24 孔板，待細胞貼壁密度為80%時用200 μL槍頭劃痕，按照實驗分組誘導48 h，分別于0 h 和48 h 在相同位置拍照，采用IPP 6.0 圖像分析軟件測量劃痕區域面積，并計算遷移百分比，即（0 h面積-48 h面積）/0 h面積×100%。

1.2.3 免疫細胞化學染色 常規制備細胞玻片，高壓修復及封閉內源性過氧化物酶后，一抗E-鈣黏蛋白（1∶200）4 ℃過夜，二抗37 ℃孵育20 min，DAB 顯色，鏡下控制，蘇木素輕度復染，中性樹膠封片。

1.2.4 蛋白質印跡法 采用RIPA 裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。按照20微克/泳道上樣，13%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜；E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-SMA、GAPDH 一抗（1∶1 000）4 ℃過夜，二抗（1∶3 000）37 ℃孵育45 min，ECL 發光。采用IPP6.0 圖像分析軟件測定條帶光密度值，以相應內參（GAPDH）的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3統計學方法采用SPSS 13.0 統計學軟件，數據以xˉ±s表示。多組間采用完全隨機設計的單因素方差分析，多重比較方差齊采用LSD-t檢驗的方法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SRF基因沉默抑制TGF-β1介導的Eca-109食管癌細胞的遷移能力如圖1所示，方差分析結果顯示（F＝105.462，P＜0.001），方差齊（F＝1.519，P＝0.293）采用LSD-t檢驗，與陰性對照siRNA 組（10.00±2.00）%相比較，TGF-β1+陰性對照siRNA組的遷移百分比為（50.67±4.73）%，差異有統計學意義（P＜0.001）；與TGF-β1+陰性對照siRNA相比較，TGF-β1+SRF-siRNA 組細胞遷移百分比為（29.00±3.00）%，差異有統計學意義（P＜0.001）。

2.2 SRF基因沉默抑制TGF-β1介導的Eca-109食管癌細胞的EMT進程如圖2 所示，免疫細胞化學染色結果顯示，E-鈣黏蛋白陽性表達于細胞膜，陰性對照siRNA 組可見明顯的E-鈣黏蛋白膜陽性表達，TGF-β1+陰性對照siRNA 組E-鈣黏蛋白膜陽性表達減少，與TGF-β1+陰性對照siRNA 組相比較，TGF-β1+SRF-siRNA組E-鈣黏蛋白膜陽性表達增多。

如圖3、表1 所示，蛋白質印跡法結果顯示，與陰性對照siRNA組相比較，TGF-β1+陰性對照siRNA組E-鈣黏蛋白表達下調（P＜0.001），而N-鈣黏蛋白、SRF、α-SMA 蛋白表達上調（均P＜0.001）；與TGF-β1+陰性對照 siRNA 組相比較，TGF-β1+SRF-siRNA組E-鈣黏蛋白表達上調（P＝0.001），而SRF、N-鈣黏蛋白、α-SMA 蛋白表達下調（P＜0.001；P＝0.001；P＝0.003），經方差分析（LSD-t檢驗），兩兩比較均差異有統計學意義（P＜0.05）。

3 討論

圖3 血清應答因子（SRF）基因沉默對E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達的影響（蛋白質印跡法）

表1 血清應答因子（SRF）基因沉默對E-鈣黏蛋白、SRF、N-鈣黏蛋白、α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）蛋白表達的影響/xˉ± s

目前研究發現，SRF 在多種腫瘤中，包括甲狀腺癌［7］、肝癌［8］、胃癌［9］等多種腫瘤中異常高表達，并與腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲能力有關［10-12］。SRF能夠與miR-199a-5p啟動子結合并促進其轉錄，而miR-199a-5p 則能夠與E-鈣黏蛋白mRNA 結合從而抑制其表達［4］。采用TGF-β1誘導Eca-109食管癌細胞，能夠顯著促進其遷移和侵襲能力，下調E-鈣黏蛋白的表達，上調間質表型包括N-鈣黏蛋白、波形蛋白（Vimentin）、Slug等蛋白的表達，同時通過上調細胞周期蛋白 D1 的表達從而促進了 Eca-109 細胞的增殖［13］。本課題組前期研究也發現，基因沉默SRF 能夠下調β-連環蛋白、細胞周期蛋白D1的表達，同時上調E-鈣黏蛋白的表達，從而抑制了Eca-109 食管癌細胞的增殖和侵襲能力［6］。在本研究中也發現，TGF-β1能夠顯著上調SRF 的表達，同時促進Eca-109 食管癌細胞的遷移能力的提高，同時減少細胞間緊密連接蛋白（E-鈣黏蛋白）的表達，并促進間質表型（N-鈣黏蛋白、α-SMA）的改變，誘導了食管癌細胞發生EMT。基因沉默SRF 則能夠顯著抑制TGF-β1 誘導的Eca-109 食管癌細胞發生EMT，并降低了其遷移能力。

圖1 血清應答因子（SRF）基因沉默對轉化生長因子β1（TGF-β1）介導的Eca-109食管癌細胞遷移的影響（細胞劃痕實驗）

SRF 及其轉錄輔因子心肌相關轉錄因子（Myocardin-related transcription factors，MRTF）是調節肌動蛋白的重要轉錄因子，在細胞黏附、細胞收縮、細胞骨架蛋白、細胞外基質等方面發揮了重要的調控作用，能夠與α-SMA 基因啟動子結合并促進其轉錄［14-17］。在腫瘤研究中，α-SMA常作為腫瘤相關成纖維細胞或EMT 標記物，與腫瘤進展和轉移有關［18］。本研究結果也顯示，在TGF-β1誘導的Eca-109 食管癌細胞EMT 過程中，伴隨了α-SMA 表達的上調，而予以基因沉默SRF，能夠顯著抑制Eca-109食管癌細胞α-SMA 的表達。其他研究也顯示，在體外沉默SRF，能夠顯著抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲，并能夠抑制 EMT 進程［19］。綜上所述，SRF 在食管癌發生、發展中起到了較為重要的調節作用，可能是基因靶向治療的一個潛在靶點。

（本文圖2見插圖9-4）

圖2 E-鈣黏蛋白在Eca-109食管細胞中的陽性表達（免疫細胞化學染色×400）