麻杏石甘湯對重癥肺炎大鼠肺組織炎癥的影響及其機制

文楊，張軍，王毅

作者單位：重慶市高新區人民醫院，a急診重癥醫學科，b呼吸科，重慶400039

肺炎是一種常見的疾病，在一部分病人中變得嚴重，這取決于宿主的免疫抵抗［1］。2016 年的死亡率趨勢分析顯示，美國肺炎繼續造成的死亡人數超過任何其他傳染病，在之前的34年期間沒有任何改善［2］。即使不是致命的，肺炎也可能是嚴重的；1/5的肺炎住院病人需要進入重癥監護病房，其中1/3需要機械通氣［3］。重癥肺炎病程急，易引起多器官衰竭，病死率高。在臨床上中藥治療重癥肺炎取得良好的效果，如清燥救肺湯、清金化痰湯、通腑清熱化痰中藥等［4-6］。大量研究報道，麻杏石甘湯（MGD）在重癥肺炎的治療中具有良好的治療效果，但是，其機制尚未清晰。本研究于2018年5月至2019年1月通過肺炎克雷伯菌建立重癥肺炎大鼠模型，檢測MGD對大鼠血清中炎性因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）含量的影響，揭示MGD的抗炎功能與抑制NF-κB信號通路相關，為MGD治療重癥肺炎提供參考。

1 材料與方法

1.1材料實驗動物無特定病原體（SPF）級大鼠（230～250 g）80 只，購于湖南斯萊克實驗生物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2013-0004，遵守實驗動物管理和倫理委員會章程對動物進行飼養和相關實驗；肺炎克雷伯菌標準株購于ATCC；加味MGD 顆粒（麻黃4 g、苦杏仁10 g、生石膏20 g、甘草4 g、防風10 g、前胡10 g、黃芩10 g）由北京康仁堂藥業公司贈送；兔抗鼠核因子κB 抑制蛋白（IκBα）多克隆抗體、兔抗鼠p65 多克隆抗體、兔抗鼠磷酸化IκBα（p-IκBα）多克隆抗體購于美國Cayman Chemical；羊抗鼠辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G（IgG）抗體購于上海烜雅生物科技有限公司；大鼠TNF-α 檢測試劑盒、大鼠 IL-6 檢測試劑盒、大鼠 IL-1β 檢測試劑盒均購于碧云天；聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）購于德國羅氏診斷有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）試劑盒、ECL 發光液和RIPA 蛋白裂解液均購于大連Takara公司。

1.2方法

1.2.1 重癥肺炎大鼠模型的制造 將大鼠手術前24 h禁食，以10%水合氯醛腹腔注射麻醉。將大鼠固定后，切開頸部皮膚，暴露上段氣管，再用1 mL注射器穿刺滴入0.30 mL 的肺炎克雷伯菌液，迅速樹立固定大鼠，使菌液均勻于肺部，最后，縫合傷口并消毒。接種后正常培養大鼠，至第6 天成功建立重癥大鼠肺炎模型，標記為模型組。

1.2.2 分組與處理 MGD 制備：按照《醫療機構中藥煎藥室管理規范》煎制麻黃、杏仁、甘草、石膏。先將麻黃、杏仁、甘草、石膏用雙蒸水浸泡1 h，然后將石膏煮20 min 后將浸泡的藥材一起煎煮20 min。取第一道汁加入2 倍雙蒸水煎煮15 min 后，取出汁液，混入第一道汁，將汁濃縮至原來的體積，調整濃度至23.65 g/kg。置于4 ℃冰箱中保存備用。

分組：按照隨機數字表法將正常飼養的80只大鼠分成對照組、模型組、模型+0.9%氯化鈉溶液組、模型+MGD 組，每組20 只。對照組：正常飼養的20只大鼠；模型組：照1.2.1的方法將剩余60只大鼠進行重癥肺炎模型制造；模型+0.9%氯化鈉溶液組：將20 只模型組大鼠進行等量的0.9%氯化鈉溶液灌胃；模型+MGD 組：將 20 只模型組大鼠進行 MGD 灌胃。飼養15 d后進行大鼠眼眶靜脈采血，之后進行斷頸法處死大鼠，再無菌小心剝離完整的左肺部和右肺部，將血液和肺置于-20 ℃保存。

1.2.3 血氣指標的分析 建模結束后，對大鼠進行腹主動脈采取2 mL血液，對血氣指標動脈血氧分壓（PaO2）、動脈血二氧化碳分壓（PaCO2）和血氧飽和度（SaO2）進行分析檢測。

1.2.4 肺濕干比重的檢測 用電子天平稱量濕肺的重量，然后置于80 ℃烘箱中烘干20 h，再次稱量肺的重量，計算濕重/干重的比。

1.2.5 蘇木精-伊紅（HE）染色觀察肺組織病理變化 取適量肺組織在多聚甲醛溶液中固定30 min，置于脫水機中脫水，經透明浸蠟過夜后，進行石蠟包埋。將石蠟塊切片（厚4 μm），烤片機烘烤15 min，脫蠟、蘇木精染色10 min后，放入鹽酸乙醇中3 s，再置于氨水中5 s，最后放入伊紅中染色2 min，經二甲苯透明、中性樹脂封片后，顯微鏡觀察。

1.2.6 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量 按TNF-α 檢測試劑盒、IL-6檢測試劑盒、IL-1β檢測試劑盒說明書要求檢測大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測肺組織中IκBα、p65、p-IκBα的蛋白表達 將大鼠的右肺用無菌剪碎，再在研缽中充分研磨，用RIPA 蛋白裂解液對研磨組織進行冰上蛋白裂解30 min，提取總蛋白，以BCA法測定樣品蛋白的濃度。以4∶1的比例加入蛋白上樣緩沖液（×5），混勻，沸水浴變性5 min，離心取上清，取60 μg 目的蛋白進行SDS-PAGE 蛋白電泳。Quantity One 4.62圖像分析軟件進行條帶灰度分析，Image J分析目的條帶的灰度值，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參，以目的條帶灰度值與GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達。

1.3統計學方法采用SPSS 21.0 軟件進行分析。計量資料用xˉ±s表示，多組間數據比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MGD對肺炎大鼠肺組織病理組織觀察及血氣指標的影響結果如圖1、表1所示，與對照組相比，模型組肺組織毛細血管擴張、充血出血、淋巴細胞、單核細胞呈圍管狀浸潤，PaO2顯著降低，PaCO2顯著升高，SaO2顯著降低（P＜0.01）；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組肺組織有少量或無炎癥細胞，PaO2顯著升高，PaCO2顯著降低，SaO2顯著升高（P＜0.001）。

表1 麻杏石甘湯（MGD）對重癥肺炎大鼠血氣指標的影響/xˉ±s

2.2 MGD對肺炎大鼠肺組織濕干比重的影響四組濕干比整體比較，差異有統計學意義（F＝14.686，P＜0.001）。與對照組相比，模型組濕干比顯著升高［（5.31±0.51）%比（3.98±0.33）%，P＜0.05］；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組濕干比顯著降低［（4.29±0.40）%比（5.28±0.48）%，P＜0.05］。

2.3 MGD對肺炎大鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β的影響結果如表2所示，與對照組相比，模型組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量均顯著升高（P＜0.001）；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD組大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量顯著降低（P＜0.001）。

表2 麻杏石甘湯（MGD）對重癥肺炎大鼠血清中炎性因子腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細胞介素6（IL-6）、白細胞介素1β（IL-1β）的影響/xˉ± s

2.4 MGD對肺炎大鼠肺組織中NF-κB信號通路活性的影響結果如圖2、表3所示，與對照組相比，模型組大鼠肺組織中IκBα的蛋白表達量顯著降低，p65、p-IκBα 的蛋白表達量均顯著升高；與模型+0.9%氯化鈉溶液組相比，模型+MGD 組大鼠肺組織中IκBα的蛋白表達量顯著升高，p65、p-IκBα的蛋白表達量均顯著降低（P＜0.05）。

圖2 麻杏石甘湯（MGD）對重癥肺炎大鼠肺組織中核因子-κB（NF-κB）信號通路表達的影響（蛋白質印跡法）

表3 麻杏石甘湯（MGD）對重癥肺炎大鼠肺組織中核因子-κB（NF-κB）信號通路活性的影響/xˉ± s

3 討論

MGD是由麻黃、杏仁、石膏、甘草組成，源于《傷寒雜病論》，具有清肺平喘的功效［7］。程永華等［8］在重癥肺炎的病人中發現，MGD輔助西藥對重癥肺炎病人具有抑制炎性分泌、改善呼吸功能，緩解病情的功能，在臨床上具有較好的治療作用。張怡等［9］報道，加味MGD可抑制重癥肺炎病人血清中炎性因子的表達，并下調前白蛋白和高遷移率族蛋白B1的表達。姜麗等［10］報道，MGD的主要藥理成分在RSV肺炎大鼠中的吸收明顯優于正常大鼠的吸收。本研究建立了肺炎克雷伯菌誘導的重癥肺炎大鼠模型發現，MGD可抑制重癥肺炎大鼠血液中炎性因子的含量。

NF-κB是炎癥和免疫反應的重要中介［11-13］，可通過誘導巨噬細胞表型的重要炎癥介質，如TNF、IL-6、白細胞介素8（IL-8）、IL-1β、白細胞介素12（IL-12）和細胞色素C 氧化酶-Ⅱ（COX-Ⅱ）［14-16］。中藥安腸愈瘍湯可治療潰瘍性結腸炎大鼠結腸組織中炎性因子的含量，其功能與抑制NF-κB 的表達相關［17］；犀角地黃湯加味可通過抑制NF-κB 信號通路的激活減輕敗血癥導致的小鼠肺部炎癥和損傷［18］；補肺湯可劑量依賴性調節Toll樣受體2（TLR2）/NF-κB信號通路改善慢性阻塞性肺疾病大鼠氣道重塑［19］；藤莓湯可通過調節腫瘤壞死因子受體作用因子3（TRAF3）/NF-κB 信號通路改善膠原誘導性關節炎模型大鼠滑膜免疫炎性損傷［20］。本研究運用蛋白質印跡法檢測了重癥肺炎大鼠肺組織中NF-κB 信號通路相關蛋白IκBα、p65、p-IκBα 的表達發現，該通路在重癥肺炎模型大鼠中的表達明顯升高，經MGD 治療后，NF-κB 信號通路的活性明顯受到抑制，提示MGD在重癥肺炎大鼠中的治療功能的機制與失活NF-κB 信號通路有關。這些結果為探索MGD 的功能機制的研究提供了參考，也為MGD 治療重癥肺炎提供了更充分的理論依據。

（本文圖1見插圖9-3）

圖1 重癥肺炎大鼠肺組織病理圖片（HE染色×200）：A為對照組，B為模型組，C為模型+0.9%氯化鈉溶液組，D為模型+麻杏石甘湯（MGD）組