外源趨化劑對氣單胞菌134的趨化性及其在水稻根際定殖的影響

王玉雙，李一路，程 偉，張 敏*，郭照輝，雷 平，單世平，付祖姣，易紅偉，楊 迪

（1.湖南省微生物研究院，長沙 410009；2.湖南雙紅農科生態工程有限公司，長沙410205；3.益陽欣博農業發展有限公司，益陽 413002）

根際有益微生物因可促進植物生長，降低植物對病蟲害的感染，已經在農業等領域得到了廣泛的應用。其能夠成功應用并發揮作用的重要前提在于能成功存活和定殖，該過程受復雜的生態環境影響[1-3]。趨化性是指微生物對多種化學物質的濃度梯度產生趨向或離避響應的行為，是微生物為適應環境而自我保護的一種基本屬性[4]。已有大量研究表明，趨化作用有助于根際微生物在根際的定殖[5-7]。趨化作用的產生與植物根系在生長發育過程中產生的根系分泌物密切相關。根系分泌物中的糖類、氨基酸、小分子有機酸等都可作為特定的信號物質誘導根際微生物的趨化，進而促進其在植物根際的定殖[8-11]。Tan等[12]研究表明，番茄根系分泌的有機酸，尤其是蘋果酸，可顯著誘導枯草芽孢桿菌T-5（Bacillus subtilisT-5）的趨化作用。Ankati等[13]發現，花生根系分泌物中的肉豆蔻酸、硬脂酸和棕櫚酸對假單胞菌RP2（Pseudomons adaceaeRP2）在花生根際的定殖有正向影響。沈怡雯等[14]研究表明，西瓜根系分泌物中氨基酸組分能明顯促進多黏類芽孢桿菌SQR-21（Paenibacillus polymyxaSQR-21）在西瓜根際的定殖。

水稻是我國主要的糧食作物，極易富集鎘，稻米中吸收的鎘可以通過食物鏈進入人體，危害人體健康[15-16]。如何降低水稻對土壤中鎘的吸收已成為一個長期的研究熱點。目前鮮有報道通過微生物的趨化性來達到促進水稻生長及降低水稻鎘污染的研究。本研究擬開展相關工作，已從水稻根際土壤中分離出一株耐鎘菌株134，初步鑒定為氣單胞菌（Aeromonassp.），其對鎘的耐受性可達75 mg/L。以水稻根系分泌物中的常見氨基酸組分和糖類為趨化劑，考察菌株134對不同組分的趨化性，最后通過水培試驗考察外源添加趨化劑對菌株134在水稻根際定殖的影響，以期獲得可高效誘導菌株134在水稻根際定殖的趨化劑，為開發利用有效的微生物肥料提供理論支撐，為水稻鎘污染治理提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試植株

水稻品種為湘晚秈13號（Xiangwanxian 13），其種子購于湖南省水稻研究所。

1.1.2 培養基與主要試劑

BHIS（brain heart infusion supplemented）液體培養基、Hoagland營養液、趨化緩沖液都根據文獻[14]來配置。趨化劑標準品（組氨酸、亮氨酸、丙氨酸、蘇氨酸、甘氨酸、葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖）和牛心腦浸液培養基均購于長沙鼎國生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻苗培育

水稻種子用70%乙醇消毒15 min，用去離子水清洗3遍，均勻鋪至帶孔盆內，然后用濕紗布覆蓋，置于溫度為30℃、濕度為50%的人工氣候培養箱中培育，待種子發芽長至1 cm左右，移栽至水培盒內繼續生長。

1.2.2 耐鎘菌株的分離純化

從湘潭鎘污染水稻田中取水稻根際土制成土壤懸液，用無菌水進行梯度稀釋，取0.1 mL涂布在預先已加入CdCl2的細菌平板上，30℃下恒溫培養1～2 d，挑取單菌落，經多次劃線、分離純化獲得純菌株。

1.2.3 菌株的鑒定

1.2.3.1 形態學鑒定

將純化后的菌株在細菌培養基上培養，觀察細菌菌落生長特征，注意其形狀、大小、顏色等，并作記錄。

1.2.3.2 生理生化鑒定

按照東秀珠等[17]編著的《常見細菌系統鑒定手冊》進行生理生化試驗。

1.2.3.3 16S rDNA序列分析

取純菌株134對數生長期的新鮮菌液1 mL，離心并收集菌體，用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提取總DNA，采用細菌通用引物（27F和1492R）進行PCR擴增，將擴增產物測序，利用BLAST軟件將所測得的序列與GenBank數據庫中已登錄的序列進行同源性比較，并采用MEGA6構建系統發育樹[18]。

1.2.4 菌株134對外源趨化劑的趨化研究

1.2.4.1 試驗設計

參考郝文雅等[19]的研究，選取水稻根系分泌物中存在的氨基酸（蘇氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、組氨酸）和糖類（果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖）進行趨化試驗分析。試驗前配置濃度分別為0、40、60、80和100 μmol/L的各趨化劑標準液，過濾除菌后備用。

1.2.4.2 趨化作用定性分析

參照Grimm等[20]的滴定分析法，并作適當修改。將活化好的菌株134種子液按1%的接種量接入BHIS液體培養基中，搖床（30℃、170 r/min）振蕩培養至對數生長期（OD600nm=0.8）。取50 mL發酵液于室溫5 000 r/min離心，收集菌體并重懸于12 mL趨化緩沖液中，再加入4 mL 1%的羥丙基甲基纖維素制成菌懸液，充分混勻后倒入直徑為6 cm的細胞培養皿中，每皿約4 mL。然后向培養皿正中央分別滴入10 μL各趨化劑標準液并在室溫條件下靜置30 min，觀察培養皿中央趨化圈的變化情況。以添加趨化緩沖液作為對照組。

1.2.4.3 趨化作用定量分析

本文采用類毛細管試驗法[21]，在BHIS液體培養基中接種過夜活化好的菌株134種子液，30℃、170 r/min振蕩培養至對數期（OD600nm=0.8），將發酵液于室溫5 000 r/min離心后重懸于等體積趨化緩沖液中制成菌懸液，用移液槍吸取100 μL菌株134菌懸液置于無菌操作臺中備用。用1 mL注射器作為試驗用毛細管，分別吸取100 μL不同濃度（0、40、60、80 和 100 μmol/L）的趨化劑標準液，將注射器針頭插入上述移液槍頭的細口端，使趨化劑標準液與菌懸液充分接觸并靜置2 h。小心取出注射器針頭，對注射器中的趨化劑標準溶液采用平板稀釋涂布法進行細菌計數。每個處理設置3次重復，以趨化緩沖液作為對照，計算3個重復平板菌落數的平均值。趨化性指數（relative chemotaxis indix，RCI）值為處理組菌落形成單位（colony forming units，CFU）的平均值與相應對照組CFU的比值，有研究表明，當RCI大于2.00時即可認為處理的趨化性與對照相比差異顯著[14]。

1.2.5 外源添加趨化劑對菌株134在水稻定殖的影響

本試驗中水稻采取水培的模式進行培養。將培養至對數期的菌株134離心重懸于水培盒營養液中，使其終濃度約為106CFU/mL，并充分混勻。將培養至4片葉的水稻幼苗根系在趨化劑標準溶液中浸泡后移栽至水培盒，對照以趨化緩沖液代替，每個處理設置3組重復。將水培盒置于28℃人工氣候培養箱（光照16 h/黑暗8 h）中培育3 d，然后收集水稻根系并對根際定殖的菌株134進行平板涂布計數。

1.3 數據分析

該試驗所有數據處理及繪圖采用Microsoft Excel（2003）軟件完成，各處理間的方差分析和差異顯著性檢驗采用SPSS 13.0統計軟件完成。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經濃度梯度培養分離，篩選出一株在液體細菌培養基中耐鎘質量濃度為75 mg/L的菌株134，該菌株菌落形態為圓形，直徑為1～3 mm，菌體呈短桿狀，革蘭氏染色為陰性（圖1）。

對分離菌134進行生化鑒定，結果見表1。該菌株接觸酶和氧化酶試驗呈陽性，且甘露醇、葡萄糖、水楊素、N-乙酰葡萄糖胺、D-核糖、麥芽糖、葵酸鹽、戊酸鹽、乙酸鹽、組氨酸、L-丙氨酸、糖原、L-脯氨酸和L-絲氨酸試驗反應也均為陽性。對該菌進行溶血試驗觀察，結果為陰性。

以菌株134的總DNA為模板，通過PCR擴增并經測序和Blast比對，選取與其同源性高的16S rDNA序列，利用MEGA 6構建系統進化樹（圖2）。由結果可以看出，氣單胞菌屬（Aeromonas）與菌株134序列同源性最高，再接合形態特征及生理生化鑒定結果，可初步鑒定此分離菌株134為氣單胞菌。

圖1 菌株 134的菌落（a）及形態表征（b）Fig.1 Colony(a)and morphology(b)characterization of strain 134

2.2 菌株134對不同氨基酸組分的趨化性研究

滴定分析法定性試驗結果通過測量試驗過程中培養皿中形成的透明圈的大小來表示。有透明圈的產生就說明菌株134在試驗過程中向培養皿中心的趨化劑標準液游動，即產生了趨化作用。結果如表2所示，菌株134對這5種氨基酸均表現出趨化性，其中對組氨酸的趨化性最強，亮氨酸和丙氨酸次之。

選擇效果明顯的3類氨基酸進行不同濃度的類毛細管定量試驗，結果表明（圖3），菌株134對各個濃度的組氨酸均表現出明顯的趨化性，RCI均大于 2.00，當其濃度為 40 μmol/L 時，RCI值達到 7.20，趨化作用最強。當亮氨酸濃度為80 μmol/L及以上時，菌株134表現出明顯的趨化性，尤其是濃度為80 μmol/L時，其 RCI值達到 4.90，低濃度時菌株134的趨化性較弱。當丙氨酸的濃度為中等濃度（40～60 μmol/L）時可以誘導菌株 134 一定的趨化性，RCI值為 2.25～2.57。

2.3 菌株134對不同糖類的趨化性研究

滴定分析法定性試驗結果表明（表2），除蔗糖外，菌株134對葡萄糖、麥芽糖及果糖均表現出明顯的趨化性。菌株134對葡萄糖和果糖的趨化性較強，其次為麥芽糖。選擇這3種糖類進行不同濃度的類毛細管定量試驗，結果如圖4所示，菌株134對各個濃度的葡萄糖和果糖均表現出明顯的趨化性，RCI均大于2.00。不同的是，菌株134對葡萄糖的趨化強度隨葡萄糖濃度的升高呈先上升后下降的趨勢，濃度為 60～80 μmol/L 時，RCI值達到 7.00 以上。而菌株134對果糖的趨化強度隨濃度升高幾乎都呈上升趨勢。當果糖濃度為100 μmol/L時，RCI值達到5.00。當麥芽糖的濃度為40 μmol/L時可以誘導菌株134一定的趨化性，RCI值為2.47，當其濃度繼續上升時，菌株134表現出的趨化性很弱，RCI值都小于2.00。

表1 分離菌株134主要生化特征檢測結果Tab.1 Main biochemical characteristics test results of the isolate 134

圖2 分離菌株134的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis of the isolate 134

表2 菌株134對氨基酸和糖類的趨化性Tab.2 Chemotaxis of strain 134 to amino acids and sugars

2.4 外源趨化劑對菌株134在水稻根際定殖的影響

由前面的趨化性試驗結果可以看出，菌株134對組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖具有較強的趨化性，選擇這4種趨化組分及其趨化效果最強的濃度（分別為 40、80、60 及 100 μmol/L）設計水培試驗，進一步驗證外源趨化劑對菌株134在水稻根際定殖的影響。計數結果如圖5所示，這4種趨化組分均能促進菌株134在水稻根際的定殖，除組氨酸外，其他3組處理與對照均存在顯著差異（P<0.05），尤其是葡萄糖和果糖的處理，與對照相比差異極顯著（P<0.01）。亮氨酸、組氨酸、葡萄糖及D-果糖這4種 趨化組分處理的根際定殖細菌數量分別為對照的2.29、1.32、3.48及 3.87倍。

圖3 菌株134對不同濃度氨基酸的趨化反應Fig.3 Chemotactic response of strain 134 toward different cocentrations of amino acids

圖4 菌株134對不同濃度糖類的趨化反應Fig.4 Chemotactic response of strain 134 toward different cocentrations of sugars

圖5 根系浸潤不同趨化劑后菌株134在水稻根際的定殖數量Fig.5 The population levels of strain 134 recruited by rice roots after adding different chemotacticum to the rhizosphere

3 討論

根際有益微生物在農業應用中擁有極大的潛能，其發揮作用的前提是能夠在植物根際中成功定殖。根際微生物的定殖能力不僅與自身特性相關，更是受植物根系分泌物的影響[22]。植物根系分泌物含有豐富的有機物質，如氨基酸、糖類、有機酸、蛋白質及次級代謝產物。這些有機物質不僅能為土壤微生物的生長和寄生提供豐富的養分，同時還可以作為信號分子調控土壤微生物之間或者微生物與寄主之間的互作[3,7]。已有大量研究表明，根系分泌物在根際微生物定殖過程中發揮著重要的作用。如Susana 等[23]發現，假單胞菌 SR1（Pseudomons adaceaeSR1）在小麥和玉米的根系定植可以促進植物生長、增產并且可降低施肥量。Cao等[24]研究發現，枯草芽孢桿菌SQR9（Bacillus subtilisSQR9）在黃瓜根際定殖中可以抑制黃瓜根際尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）的生長，保護寄主免受病原菌的侵害。而目前關于水稻根系分泌物-根際有益微生物-水稻重金屬抗性的研究報道很少。本文基于此開展系統的研究工作，目前從水稻根際中分離出一株高耐鎘氣單孢菌134，在模擬添加水稻根系常見分泌物后，可成功定殖于水稻根際。

根系分泌物與根際微生物相互作用的一個重要的研究方向即為兩者之間的趨化性。趨化性是一種重要的運動特性，允許細菌向根表面移動，對根系分泌物的正趨化是細菌定殖的一個基本特性[4,8]。本試驗中，除蘇氨酸與蔗糖外的其他趨化劑均能使菌株134產生趨化圈，其中組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖對氣單胞菌134具有較強的趨化性。Jin等[7]研究表明，韋氏桿菌 S3-1（Bacillus velezensisS3-1）對玉米根系分泌物中的葡萄糖和蘋果酸有強趨化作用；楊姍姍等[25]研究表明，葡萄糖、組氨酸、亮氨酸和精氨酸等均能誘導西瓜嗜酸菌（Acidophilus）向其正趨化。本研究結果與前人研究結果基本一致。

趨化劑的濃度對細菌的正趨化作用有直接影響。Thimmaraju 等[26]研究表明，在 0～30 μmol/L 的濃度范圍內，蘋果酸對枯草芽孢桿菌FB17（Bacillus subtilisFB17）的趨化作用隨著濃度的升高而增強。Yuan等[6]研究發現，芽孢桿菌 NJN-6（Bacillus amyloliquefaciensNJN-6）對于有機酸的趨化作用隨濃度的升高而呈先增強后減弱的趨勢，其對于中等濃度（25～50 μmol/L）的有機酸的趨化作用最強。本研究結果發現，不同濃度趨化底物對氣單胞菌134的趨化作用也各不相同，當組氨酸、葡萄糖和果糖濃度在40～100 μmol/L時，均可誘導菌株134產生較強的趨化性，其CRI值都在2.00以上。尤其是當組氨酸濃度為 40 μmol/L，葡萄糖濃度為 60 μmol/L 時，趨化作用最強，RCI值高達7.00以上。

為了進一步證實這些趨化劑對于氣單胞菌134在根際定殖中的影響，本研究采取水培試驗來考察菌株134在水稻根際的定殖情況。結果表明，滴定分析法定性試驗中現象最明顯的4種趨化劑組氨酸、亮氨酸、葡萄糖及D-果糖均能促進菌株134在水稻根際的定殖，尤其是葡萄糖和D-果糖的處理與對照組的差異極為顯著，但在實際農田應用中，其促進菌株134在水稻根系定殖的情況還有待進一步研究驗證。

植物根際是一個復雜的生態環境，其根系和根際微生物的共同作用可以改變根際環境，影響根際土壤中的各種生物有效性。采用人工施加根際有益微生物，可以改變根際生態環境的群落結構，利于植物的生長及抵抗逆境，在微生物肥料的研發上具有很大的潛力。本研究小組前面報道過，在水稻根際接種高耐鎘檸檬酸桿菌XT1-2-2（Citrobactersp.XT1-2-2）可以明顯地促進水稻的生長，提高水稻的生物量并降低稻米對鎘的吸收[27]。本研究中的氣單胞菌134分離自鎘污染水稻的根際土壤，對鎘耐受性較強。但關于菌株134在水稻根際定殖后對水稻的生長及降鎘的影響還未開展試驗。接下來將重點研究在趨化劑的誘導下菌株134在土培水稻根際的定殖情況，以及定殖成功的菌株134對水稻的生長及降鎘效果的影響，以期為研究菌株134與水稻根系的互作機制、目標菌株的實際農業應用提供參考。