不同抗原修復方法在免疫組織化學染色中的應用效果比較

段會娟

(河南科技大學第一附屬醫院 病理科，河南 洛陽 471003)

免疫組織化學技術已經成為當今生物醫學中形態、功能代謝綜合研究的一項有力的工具，其應用范圍深達醫學的各個學科，是目前生命科學工作者應該掌握的基本技術之一。免疫化學實驗時主要采用組織標本與細胞標本，若形態保存良好，可連續進行切片，用于各種染色觀察。但是標本組織制作時甲醛的固定過程可導致細胞內抗原形成醛鍵、羥甲基等從而引起抗原的決定簇被封閉。在組織固定過程中，甲醛與蛋白質發生交聯，可封閉抗原，因此在免疫組織化學染色后鏡下觀察發現陽性物反應不強，時隱時現，表達不均勻，有時可出現假陰性。因此為了較好地暴露抗原，需進行抗原修復[1]。常用的抗原修復法有微波修復法、高壓加熱法、酶消化法、水煮加熱法等，雖然進行免疫組織化學染色可借助抗原修復程序，但是設備成本較高，手工操作法仍是較為普遍的使用方法，各個實驗室會根據自身的習慣等選擇不同的修復方法。基于此，本研究對比不同抗原修復方法在免疫組織化學染色中的應用效果。

1 資料與方法

1.1 材料收集河南科技大學第一附屬醫院2017年10月至2019年11月95例手術送檢的食管癌組織標本，均經福爾馬林固定，脫水后石蠟包埋。標本進行連續切片，厚度約為4 μm，并放入載玻片內(經過防脫處理)，放置于60 ℃烤箱中烤6 h左右。

1.2 試劑及儀器試劑包括CD8、CD4、Ki67、白介素-17(interleukin 17，IL-17)、pH為6.0的枸櫞酸液、pH為7.2的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、即用型免疫組織化學SP試劑盒。所有試劑盒均選購自北京諾博萊德公司。儀器包括高壓消毒鍋、微波爐等。

1.3 操作方法將石蠟標本進行脫蠟水化后，置于體積分數0.3%的H2O2甲醛中浸泡10 min，氧化物活性消除后開始抗原修復。(1)高壓抗原修復法：將切片放置于枸櫞酸鹽緩沖液(約2 000 mL)中，放置于高壓鍋內加熱至沸騰，蓋上壓力閥后至噴汽后持續1～4 min，取出修復液恢復室溫后，采用PBS沖洗3次，然后按照選好的免疫組織化學法進行染色。(2)水浴修復法：將盛有修復液的耐高溫染色盒放置于水浴鍋中，加熱到95～99 ℃，加入切片(甩干水分)，采用保溫檔(不擰緊壓力閥)，處理20 min左右，然后將染色盒與切片一起放置于冷水中進行隔水降溫，冷卻后，沖洗玻片上的修復液，然后進行染色處理。(3)微波輻射抗原修復法：將枸櫞酸液放置于微波爐內的高溫塑料切片架上，并將切片豎立其中，在微波爐內輻射20 min，取出后處理與高壓抗原修復法一致。

1.4 評價指標對3種方法修復后的免疫組織化學染色結果進行分析。陽性標準為：CD8、CD4細胞膜顯示棕黃色，Ki67細胞核、IL-17細胞質顯示棕黃色。根據呈現的顏色進行計分：不著色計0分，深棕黃色計1分，棕黃色計2分，深棕色計3分。根據陽性細胞的百分率進行評分，其中百分率<5%為0分，5～25%為1分，26%～75%為2分，>75為3分。根據以上兩項得分之和將細胞陽性程度劃分為陰性(-)、弱陽性(+)、陽性(++)、強陽性(+++)，其分別為0～1分、2～3分、4～5分、6分。

1.5 統計學方法采用SPSS 23.0統計軟件進行數據處理，陽性率用率(%)表示，采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

采用高壓抗原修復法修復，CD4抗體陽性率較其他兩種方法高，差異有統計學意義(均P<0.05)。三種抗原修復法下CD8、Ki67、IL-17抗體陽性率對比，差異無統計學意義(均P>0.05)。高壓修復法CD8、CD4、IL-17強陽性占比高于微波輻射修復法、水浴修復法(均P<0.05)。見表1。

表1 兩組不同抗原修復法后免疫組織化學染色結果對比(n，%)

3 討論

免疫組織化學染色主要利用抗原抗體的特異性原理，通過一系列的化學反應來對抗體進行顯色，從而對抗原進行有效研究。其技術可將抗原的形態特點、功能等變化結合起來，可精確地反映亞細胞結構水平。但是，制作組織標本時主要采用甲醛進行固定，可造成部分抗原決定簇被封閉，因此進行染色時部分標本組織無法顯色，所以需對抗原進行修復或使其暴露，恢復其原有的空間形態[2-3]。抗原修復的方法目前還未標準化，暫時還未發現任何一種抗原修復法適用于各種抗體，抗原的修復效果受到多種因素的影響，臨床實際操作過程中需不斷提高免疫組織化學技術水平，從而為病理診斷提供更為可靠的依據。

枸櫞酸鹽緩沖液pH為6.0，比較適用于大多數抗原，修復方法較多，如微波輻射抗原修復法、高壓抗原修復法、水浴修復法等。微波輻射抗原修復法主要利用微波的快速運動產生的瞬間熱作用來達到抗原修復的目的，微波輻射可以使各種物質分子進行極性運動，從而導致已經形成的醛鍵斷裂，當分子間運動所產生的瞬間熱達到有效的溫度后，可促進甲醛固定后的蛋白變性[4]。微波輻射抗原修復法可迅速產生熱力，且容易操作，該方法也較為柔和，但是液體容易干涸，因而前期準備時需要足夠量的修復液，避免出現操作失誤。高壓抗原修復法主要利用高熱來促進醛鍵斷裂，當加上高壓閥加熱至沸騰，氣體噴出時的溫度可達到121 ℃左右，對一些較難修復的抗原修復效果較佳[5-6]。水浴法較為簡單，作用較為溫和，緩沖之后不易脫片，但是染色效果較差，顏色表現深淺不一，易產生假陰性，具有一定的局限性。

免疫染色是免疫組織化學技術最為關鍵的一步，在進行修復時標志物借助于熒光素、酶等標記抗體與組織切片或細胞涂片中相關的抗原結合，其中熒光素產生的熒光可用熒光顯微鏡觀察，而酶通過一定的顯色處理，呈現出醒目的陽性色彩，進而可較為準確地定位欲測定的抗原物質，達到診斷、鑒別診斷和研究的目的。本研究采用高壓抗原修復法，CD4抗體陽性率為100.00%，而采用微波輻射修復法CD4抗體陽性率為49.47%，水浴修復法CD4抗體陽性率為43.16%，這3種方法對比，與微波輻射修復法、水浴修復法比，應用高壓修復法CD4抗體陽性率較高。采用這3種方法時，CD8、Ki67、IL-17抗體陽性率差異無統計學意義，且分析染色強度可見高壓修復法CD8、CD4、IL-17呈現的強陽性率高于微波輻射修復法、水浴修復法，由此可見高壓修復法下組織切片多呈均勻一致的強陽性，因而定位更為準確。綜合考慮，采用高壓抗原修復法的效果最佳。但是，利用高壓鍋修復時易產生劇烈運動，可導致標本出現脫片現象，因此若3種修復方式抗體陽性率差異不大，也可選擇微波輻射修復法或水浴修復法。

綜上所述，采用高壓抗原修復法的總體效果優于微波輻射修復法、水浴法修復，但由于實際運用時易導致脫片，因此在3種修復方式抗體陽性率差異不大的情況下，可選擇微波輻射修復法或水浴法修復法，臨床實際操作時需根據不同抗原修復特點選用合適的修復方法。