不同類型標本新型冠狀病毒(SARS-CoV-2)核酸檢測結果比較

戎庭軍，李雄偉，胡文壇，匡一鳴

(信陽市中心醫院 醫學檢驗科，河南 信陽 464000)

2019年12月，我國湖北省武漢市暴發新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)，截止2020年3月1日，中國已累計報告確診病例80 026例，累計死亡2 912例[1]；中國境外共58個國家累計確診7 169例，死亡104例。SARS-CoV-2屬于β屬的冠狀病毒，為單鏈正義RNA病毒，主要通過呼吸道的飛沫和接觸傳播，通常在人類和動物中引起呼吸、消化和神經系統疾病[2-3]。冠狀病毒曾引起了2次全球性傳播的嚴重呼吸道傳染病，其中1次是2003年在中國廣東省發生的嚴重急性呼吸系統綜合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，俗稱非典型性肺炎[4-5]，另一起是2012年在沙特阿拉伯暴發的中東呼吸綜合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)[6]。但是SARS-CoV-2基因特征與SARS-CoV和MERS-CoV有區別，目前的研究顯示SARS-CoV-2與蝙蝠SARS樣冠狀病毒(bat-SL-CoVZC45)的同源性達85%以上[7]。

對于疑似新型冠狀病毒感染患者的確診，除了有病毒性肺炎的流行病學史、臨床癥狀和影像學特征外，SARS-CoV-2核酸陽性結果是確診的“金標準”[8]。然而對于呼吸道疾病病毒核酸檢測，標本質量直接影響檢測結果的準確性。目前，臨床提供用于SARS-CoV-2核酸檢測的標本多種多樣，常見的標本如呼吸道分泌物和支氣管、肺泡灌洗液等，另外也有報道表明部分患者的糞便中也檢測出SARS-CoV-2[9]，但是無論用哪種類型的標本進行SARS-CoV-2檢測均有一定的假陰性率。因此，闡明不同類型標本SARS-CoV-2陽性檢出率對SARS-CoV-2檢測工作及COVID-19患者的確診和治療效果評價尤為重要。本文采用回顧性研究方法，收集了2020年2月1日至2020年3月1日在信陽市中心醫院確診和治療的新型冠狀病毒患者的咽拭子、痰液和糞便標本，采用熒光定量PCR法分別進行SARS-CoV-2核酸檢測，以獲得不同類型標本的SARS-CoV-2核酸陽性檢出率，為SARS-CoV-2的檢測工作、COVID-19患者的診斷和治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性收集2020年2月1日至2020年3月1日在信陽市中心醫院就診治療的COVID-19患者26例，由臨床醫護人員分別采集咽拭子、痰液和糞便標本保存在含有病毒保存液的樣本保存管內，及時送至檢驗科PCR實驗室進行SARS-CoV-2核酸檢測。

1.2 試劑與儀器SARS-CoV-2核酸檢測提取和測試劑盒(熒光PCR法)來自上海捷諾生物技術股份有限公司，ABI7500型熒光定量PCR儀購自美國Thermo Fisher公司，生物安全柜購自山東博科生物產業有限公司，恒溫金屬浴購自杭州博日科技有限公司，高速離心機購自湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司。

1.3 SARS-CoV-2核酸檢測按照SARS-CoV-2核酸提取試劑說明，向痰液標本中加入等體積乙酰半胱氨酸溶液(10 g·L-1)，混勻，室溫靜置30 min，再將保存于病毒保存液的咽拭子標本和糞便標本分別用一次性吸管吹打7～8次，室溫靜置5 min。所有標本1 000 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL放置于1.5 mL EP管中，再加入600 μL病毒裂解液，震蕩混勻，室溫靜置10 min，加入800 μL的上柱結合液并混勻；將混合液分2次轉入到核酸提取柱內并16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體；向離心柱內加入700 μL清洗液，16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體；再向離心柱內加入300 μL清洗液，16 000 r·min-1離心1 min，棄掉收集管中液體，再16 000 r·min-1離心2 min；將離心柱放入新的收集管內，加入50 μL的洗脫液，室溫靜置2 min，16 000 r·min-1離心2 min，收集管中RNA溶液用于熒光定量PCR檢測。按照1份反應體系13 μL PCR混合液和5 μL PCR酶溶液的比例配制PCR反應液，每孔18 μL分裝到八連管中，再分別加入2 μL提取的RNA溶液，然后上機檢測。PCR擴增程序：第1步反轉錄，42 ℃ 5 min，1個循環；第2步預變性，95 ℃ 3 min；第3步循環擴增，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40個循環，在58 ℃檢測熒光信號。檢測SARS-CoV-2基因組中的開放讀碼框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)及編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)基因，根據試劑盒說明書提供的結果解釋，CT值小于37判定為陽性，CT值大于40或無判定為陰性，CT值在37和40之間需要復查，以1份樣本中ORF1ab和N基因雙陽性或2次采樣ORF1ab基因均陽性判定為SARS-CoV-2陽性，否則判定為SARS-CoV-2陰性。

1.4 統計與分析采用SPSS 19.0統計軟件進行數據處理，計量資料用中位數表示，計數資料用百分比表示，3組間陽性檢出率比較采用Cochran’sQ檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

26例患者中，男12例，女14例，年齡27～73歲，中位年齡47.5歲。在26例患者的咽拭子標本中，檢測出SARS-CoV-2核酸陽性的為18例，陽性率為69.23%；痰液標本中檢測出SARS-CoV-2核酸陽性的為25例，陽性率為96.15%；糞便標本中檢測SARS-CoV-2核酸陽性為2例，陽性率為7.69%。2例糞便標本陽性的患者咽拭子與痰液標本結果也均為陽性；1例痰液標本陰性的患者其咽拭子結果為陽性，糞便標本結果為陰性；8例患者痰液標本為陽性，咽拭子和糞便標本結果均為陰性，15例患者糞便標本結果為陰性，痰液和咽拭子標本均為陽性，具體數據見表1。RT-PCR檢測結果顯示，痰液標本陽性率最高(96.15%)，咽拭子標本陽性率次之(69.23%)，糞便標本中陽性率最低(7.69%)。痰液標本SARS-CoV-2核酸陽性檢出率高于咽拭子和糞便標本陽性檢出率，差異有統計學意義(均P<0.05)。

表1 26例患者一般資料及核酸結果

3 討論

目前對于疑似COVID-19患者主要是取咽拭子標本[10-11]，利用RT-PCR技術進行SARS-CoV-2核酸檢測；然而許多患者確診需要多次咽拭子標本核酸檢測，甚至造成漏診，其中咽拭子采集者的操作水平、檢驗試劑、檢驗人員水平、標本的運輸保存等均對結果造成影響，但是對于標本類型的選擇影響不可不考慮。本研究主要目的是利用熒光PCR技術比較同一患者不同標本中SARS-CoV-2核酸檢出率，所有納入研究的病例均為確診病例。本研究結果表明，26例COVID-19患者的不同類型標本中，痰液標本SARS-CoV-2核酸陽性檢出率最高，為96.23%，咽拭子標本核酸陽性檢出率為69.23%，糞便標本陽性率檢出率最低，僅為7.69%。這表明對SARS-CoV-2核酸進行檢測，痰液標本陽性率明顯高于咽拭子和糞便標本的陽性率。

SARS-CoV-2在痰液標本中陽性檢出率更高，一方面可能是因為臨床咽拭子采集的不規范、不標準，另一方面也可能因為該病毒主要侵襲和感染下呼吸道細胞，病毒在下呼吸道的水平遠高于上呼吸道，且當患者體內病毒水平較低時，咽拭子標本很難采集到足夠的病毒。因此，在診斷疑似患者和評估確診患者治療效果時，下呼吸道標本中痰液較咽拭子和糞便更加適合于病毒核酸檢測。

本研究仍有許多局限性：首先，納入研究的確診患者只有26例，下一步需要更多的數據來進行更深入的研究；其次，僅研究了痰液、咽拭子和糞便3種類型標本的病毒核酸陽性檢出率，沒有對血清、血漿、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、尿液等標本進行研究；最后，雖然痰液標本的病毒核酸陽性檢出率最高，但是部分確診患者并不產生痰液，這將導致痰液標本的采集十分困難。

總之，在利用RT-PCR技術檢測SARS-CoV-2核酸時，痰液標本陽性檢出率明顯高于咽拭子和糞便標本。建議對疑似COVID-19患者，首先應該采集痰液標本進行SARS-CoV-2核酸檢測，如無法采集到痰液，才可選擇咽拭子標本，這將有利于疑似患者的確診，提高臨床診斷的準確性。