無機氮源在枯草芽孢桿菌補料分批發酵核黃素中的作用

尉 文， 張夢雪， 王學東

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

核黃素（Riboflavin）又名維生素B2（VB2），它是生物體內重要的輔酶黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）和黃素單核苷酸（FMN）的前體物質，這兩種輔酶在氧化還原反應中作為電子受體，在生物代謝中起到重要作用[1]。核黃素常常用于醫藥和飼料添加劑、化妝品、食品等行業，其通常的合成方法為化學合成法和生物合成法[2-3]。隨著生物工程的發展，微生物發酵法以生產工藝簡單、原料廉價、環境友好以及資源可再生等優點逐步取代傳統的化學合成法。

核黃素發酵的主要生產菌包括:棉阿舒氏囊霉（Ashbya gossypii）、阿舒氏假囊酵母（Eremothecium ashbyii）、無名假絲酵母（Candida famata）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）等。目前，棉阿舒氏囊霉、無名假絲酵母和枯草芽孢桿菌等微生物已成功進行基因工程技術改造，并成功應用于核黃素的生產中[2]。相較于其他兩種菌株，枯草芽孢桿菌具有很多優點，如原料要求低、發酵周期短、產量高等。因此目前核黃素主要通過基因改造過的枯草芽孢桿菌進行生產，且對該菌株的發酵過程進行優化和調節代謝通量也可以極大提高核黃素的產量[3-6]。

在過去的10 年里，核黃素的研究主要集中在對生產菌株基因的分子修飾方面，鮮有對生產過程中的代謝調控尤其是氮代謝調控的研究，但氮源在菌體生長和核黃素生產中作用重要[7]。

本文針對不同的無機氮源及其組合對菌體生長和核黃素產量的影響進行了詳細的研究，并對補料分批發酵過程中銨離子濃度的調控策略進行了改進，以提高枯草芽孢桿菌發酵產核黃素能力。

1 材料與儀器

1.1 菌株

枯草芽孢桿菌，本文中使用的菌株由合作企業提供，該菌株已經過8-氮鳥嘌呤（8-AGr），氯霉素（Cmr），麥角霉素（Emr）和卡那霉素（Kanr）選育。

1.2 培養基

種子培養基 (g/L)：蛋白胨 10，酵母粉 5，NaCl 10，pH 7.0；

搖瓶發酵培養基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米漿（干粉）20，酵母粉 5，無水 MgSO45，（NH4）2SO45，KH2PO41，K2HPO43，pH 7.0；

發酵培養基 (g/L)：葡萄糖 100，玉米漿（干粉）30，酵母粉 5，尿素 5，無水MgSO41，（NH4）2SO45，KH2PO41.5，K2HPO42.42，pH 7.0。

1.3 主要儀器

GZX-9070MBE 電熱鼓風干燥箱：上海博訊實業有限公司；層析缸：上海楚定分析儀器廠；7 L 發酵罐：上海保興生物有限公司；SBA-40D 型葡萄糖檢測儀：山東省科學院生物研究所；UV2800 型紫外可見分光光度 計：UNIC 公司；Centrifuge 5415D/5804R：德國Eppendorf 公司。

2 實驗方法

2.1 培養條件

種子培養條件：搖床溫度控制在40 ℃左右，轉速控制在180～200 r/min，培養時間36 h；

搖瓶培養條件：接種量2%，培養溫度40 ℃，pH 7.0～7.2，轉速為180～200 r/min，培養周期48～60 h，結果重復3 次；

發酵培養條件：接種量2.5%，培養溫度40 ℃，pH 6.8～7.0，溶氧20%以上，轉速與溶氧聯動，發酵36～48 h。

2.2 分析方法

2.2.1 菌體濃度（Cell density） 菌體濃度用吸光度值(OD) 表征，OD 值采用紫外-可見分光光度法測得：在600 nm 下測吸光度值（即OD600），一個單位的OD600對應0.38 g 細胞干重。

2.2.2 核黃素測定 取發酵液用0.05 mol/L 的NaOH溶解20 min，在10 000 r/min 下離心3 min，上清液在444 nm 下測定吸光度值（A444），核黃素產率用A444除以0.064 2 來表示，單位為IU/mL。

2.2.3 銨離子濃度檢測方法 采用苯酚-次氯酸法檢測銨離子濃度，首先將2.5 mL A 溶液（濃縮苯酚62 g，硝基鐵氰化鈉25 g，定容為1 L，將其置于棕色瓶儲存在冰箱中）加入離心管中，然后加入20 μL 樣品，最后加入B 溶液（氫氧化鈉50 g、次氯酸鈉2.1 g，定容為1 L）。將混合溶液在37 ℃下水浴20 min，測量上清液在630 nm 處的吸光度值（A630），氨離子濃度（cNH+4，mmol/L）由計算公式A630= 0.084 8cNH+4+ 0.045 9(R2=0.999 5)得出[8]。

3 結果與分析

3.1 不同氮源對菌體生長和核黃素產量的影響

根據玉米漿（西王集團有限公司）和安琪酵母粉（安琪酵母股份有限公司）成分分析表，在初始培養基中，玉米漿中有機氮源質量分數為4.58%，安琪酵母粉中有機氮源質量分數為7.76%，尿素中有機氮源質量分數為46.7%，所以在初始培養基中，有機氮源質量分數為26.96%，無機氮源質量分數為10.6%，對于有機氮源來說，成分復雜且影響因素較多，本文數據僅作參考。

為探究不同氮源對菌體生長和核黃素產量的影響，本實驗將初始的發酵培養基作為空白對照組，隨后添加幾種常見氮源進行研究。有機氮源選擇酵母粉和尿素，根據實驗室前期培養基優化情況，添加了5 g/L 酵母粉和3 g/L 尿素；無機氮源選擇硫酸銨和硝酸鈉，使其濃度均為0.05 mol/L。發酵60 h 之后測定菌體濃度和核黃素產量，結果見表1。從表1 中可以發現，對照組OD600為12.4，產量為677 IU/mL，添加酵母粉和硫酸銨的實驗組中菌體濃度比其他實驗組高，相較于對照組，分別提高了35%和22%，但兩個實驗組的核黃素產量較低；添加了尿素和硝酸鹽的實驗組中，與對照組相比，核黃素產量有較明顯的增加，分別提高了15%和19%，而尿素對菌體生長的作用不明顯，硝酸鈉有一定的抑制現象。通過此實驗可以推測銨鹽對于菌體生長有促進作用，硝酸鹽對核黃素生產有促進作用，在培養基中可尋找二者最佳配比，此比例下既有利于菌體生長又有利于核黃素生成。

表1 不同氮源對生物量以及核黃素產量的影響Table 1 Influence on the biomass and the yield of riboflavin under different nitrogen sources

3.2 不同質量濃度硝酸鈉對核黃素產量影響

從實驗結果（表1）中發現，硝酸鹽對核黃素合成的促進效果最明顯，因此對培養基中硝酸鹽的質量濃度進行優化，搖瓶發酵60 h 后測定菌體濃度和核黃素產量，結果如表2 所示。在培養基中添加不同質量濃度的硝酸鈉對核黃素產量有不同程度提升，最高可達到832.5 IU/mL，相比于對照組的652.0 IU/mL提高了28.0%。從表中還可以看出，硝酸鈉最適質量濃度約為10 g/L。

3.3 銨離子、硝酸根離子的混合比例對核黃素產量影響

為了尋找銨鹽和硝酸鹽最佳比例，首先對比枯草芽孢桿菌在利用不同無機氮源過程中的菌體濃度、核黃素產量、 N H+4濃度以及 N O?3濃度的變化，確定氮原子的總濃度為0.1 mol/L，設計含有不同氮源組成的培養基（如表3），并對枯草芽孢桿菌進行培養，此過程控制其他成分不變，檢測發酵過程中的pH，48 h 后測定菌體濃度和核黃素產量。3 種氮源對發酵影響如圖1 所示，無機氮源對pH 的影響如圖2所示。

表2 不同質量濃度硝酸鹽對產量和菌體濃度的影響Table 2 Effect of different mass concentration of sodium nitrate on the yield and cell density

從圖1 中可以發現，在培養基a 中 N H+4濃度迅速下降，菌體生長速度最快，36 h 達到最大菌體濃度（OD600約為18），說明 N H+4有利于菌體的快速生成。但就核黃素產量而言，培養基a 的產物產量是3 種培養基中最低的。培養基b 中的核黃素含量比a 中的高，說明 N O?3在核黃素生產過程中對產量提升有重要作用，但菌體的生長在一定程度上卻受到抑制，生長狀況與培養基a 相比略顯滯后。另外在培養基c 的培養過程中， N H+4和 N O?3離子濃度同時降低，這說明了枯草芽孢桿菌對 N O?3利用不受 N H+4抑制，在生長期盡管菌體比生長速率沒有培養基a 的高，但比僅使用NaNO3作氮源的培養基b 的生長情況改善明顯。從產量上來說，培養基c 的核黃素產量是最高的，最大產量為812 IU/mL，相比培養基a 和b，核黃素產量分別提高了35%和14%。

對上述實驗結果進行分析，銨離子在氮的代謝中具有重要作用，銨離子濃度適當時有利于核黃素的生產。第一，銨離子可促進谷氨酰胺合成，而谷氨酰胺作為三磷酸鳥苷（GTP）合成所需的物質可促進GTP 的生產，而GTP 又作為核黃素生產的直接前體有利于核黃素的積累。銨離子在依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的谷氨酸脫氫酶GDH（NADPH-GDH）的作用下可以與三羧酸循環（TCA）中α-酮戊二酸生成谷氨酸，接著在谷氨酰胺合成酶（GS）作用下與谷氨酸再次反應生成谷氨酰胺[10-11]。谷氨酸合酶是由GLN1 基因編碼，在氨水平低的條件下才表達。氮源受到限制會使編碼GS 的基因去阻遏，從而激活GS 活性；當氨水平升高時則相反[12]。文獻[13]研究發現嘌呤短缺時GS 可以去阻遏，雖然具體機理了解還不透徹，但是谷氨酰胺作為嘌呤核苷酸的前體物質，可能影響其合成。第二，銨離子對菌體生長和異化代謝更加有利。谷氨酸含量與銨離子濃度成正相關，作為一種容易被利用的氮源，氨和谷氨酸主要通過氮代謝和糖酵解（EMP）、TCA 等途徑發揮作用，因此容易引起代謝發生遷移 ，同時也影響到依靠磷酸戊糖途徑（PP）進行表達的核黃素的生成。從本次實驗中也可以發現相似的規律：高濃度的銨離子對PP 途徑代謝會產生一定的抑制作用，降低核黃素產量，而適宜的銨離子濃度有利于核黃素生產。

表3 不同氮源組成的培養基中 N O?3 和 N H+4 的組合情況Table 3 Composition of N O?3 and N H+4 in different nitrogen sources media

圖2 無機氮源對pH 的影響Fig.2 Effect of inorganic nitrogen source on pH

硝酸鹽可以促進核黃素生產的原因可分為兩個：首先，硝酸鹽作為非速效氮源，在硝酸鹽還原酶的作用下經過一系列反應生成氨，而被微生物所利用，這一水解速率與菌體同化速率相匹配，使銨離子的抑制效果降低，減少了代謝遷移現象的發生，促進產物積累；其次，硝酸根離子通過影響pH 來實現對于菌體生長和核黃素產量的調控。從圖2 中可以看出，硫酸銨的加入會造成產酸加劇，整個發酵過程，pH 最低降至2.6，發酵結束時pH 約為5。而加入部分硝酸鈉或者只添加硝酸鈉的實驗組中，pH 比加入硫酸銨組更高，最高可達到將近7.0，該pH 條件更加適宜菌體生長和產物合成。NaNO3屬于生理堿性鹽，當硝酸根作為氮源被利用時，會產生OH-，使環境中pH 升高，降低過度產酸對菌體的損害。硝酸鹽釋放的生理堿性物質可以中和銨鹽被利用過程中產生的生理酸性物質，起到維持pH 穩定的作用，防止pH 劇烈波動影響菌體內酶的活性和正常生理代謝的速度。此外，根據武秋立等[14]的研究發現，影響核黃素形成的最后一個關鍵酶（核黃素合酶）的最適pH 在微堿性范圍內。從上述結果（圖2）可以看出，pH 對菌體生長和產物合成所起的作用不容忽視，具體對代謝過程中各種酶的影響有多大還有待于進一步研究。

在保證總無機氮相等條件下，進一步針對銨鹽和硝酸鹽的不同配比進行過程研究，含有銨鹽比例越高，菌體生長越快，而沒有銨鹽的培養基中菌體生長受到一定影響，表現出一定的滯后性。反之，增加硝酸鹽的比例，核黃素的產量提高。由圖1 可得，當硫酸銨與硝酸鈉物質的量之比為1∶8（培養基c）時，核黃素的產量最高，為812 IU/mL，并能使菌體較快生長。

3.4 補料分批發酵過程中銨離子濃度調控

本文初步研究了無機氮源（主要是銨鹽和硝酸鹽）的不同配比對核黃素生產和菌株生長的影響，并從代謝角度分析了銨鹽和硝酸鹽影響調控的內在機制。從核黃素的結構中可以計算出氮元素質量分數與蛋白質平均含氮量（約16%）相近，所以在發酵過程中補加氮源是必要的。在工業生產中氨水是一種常用的無機氮源，其主要作用有兩個：一是為菌體生長和產物合成提供氮源，二是調節pH。

在7 L 發酵罐中采用連續補料的形式使葡萄糖質量濃度維持在10 g/L 左右。結果表明，隨著發酵的進行，培養基底料中銨離子被菌體消耗，隨著耗糖產酸速率增加，用于調節pH 的氨水的用量也隨之增加，從而也向發酵液中不斷引入銨離子，導致發酵液中銨離子濃度也隨之增加（圖3），而過高的銨離子對于核黃素生產不利。導致這一現象的原因有3 個：第一，代謝流發生偏移，氨和谷氨酸在氮代謝過程中發揮著重要的作用，它們作為速效氮源可以被微生物優先利用。然而微生物同化 N H+4是一個消耗ATP 的過程，因此對能量的要求會加大，而能量的產生依賴碳源的利用，低的ATP 可以激活EMP 途徑關鍵酶（磷酸果糖激酶，PFK）的活性，直接導致EMP 途徑通量增加，用于生產核黃素的PP 途徑代謝通量相對減少，代謝途徑發生遷移。第二，抑制谷氨酰胺合成酶活性，降低前體物質供應。有研究[15-16]在鳥苷發酵中發現高濃度的銨離子會抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，該酶可以催化谷氨酸合成谷氨酰胺，它是核黃素的前體物質之一，該物質合成過程受阻可能會影響產物核黃素的形成。此外，高濃度的銨離子通過氮的代謝還會生成一些非必需氨基酸（如谷氨酸、丙氨酸、天冬氨酸）和有機酸（如丙酮酸）[17-18]，這些非必需氨基酸（如丙氨酸（Ala），谷氨酸（Glu））會抑制GS 活性，加劇代代謝溢流，使產物核黃素的生產速率下降，造成物質和能量的浪費。

圖3 氨水調節pH 對菌體濃度和產量的影響Fig.3 Effect of pH on cell density and yield by ammonia

為了避免發酵過程中銨離子濃度過高對核黃素產生的不利影響，本文在發酵過程中使用氨水和2 mol/L 的NaOH 交替調節pH（圖4）。當發酵進行至16～18 h，銨離子濃度降至5～10 mmol/L 時，發酵過程也將這一范圍作為調控依據。當銨離子的濃度隨著pH 的調節再次升高，超過10 mmol/L 時，改用2 mol/L 的NaOH 調節pH；當銨離子濃度低于5 mmol/L時，改用氨水調節pH，36 h 之后發酵結果如圖4 所示。將圖3與圖4 對比后發現，調控銨離子濃度使其始終維持在比較低的水平時，核黃素產量由4 791 IU/mL提高至5 292 IU/mL，同時調控前后菌體濃度變化不大。

圖4 氨水和NaOH 共同調節pH 對菌體濃度和產量的影響Fig.4 Effect of pH on cell density and yield by ammonia and NaOH

4 結 論

本文首先研究了氮源種類對菌體濃度和核黃素產量的影響。結果表明：銨鹽、酵母粉可以促進菌體生長，但卻抑制核黃素產量提高；尿素和硝酸鹽可明顯促進核黃素產量提高，對菌體生長的作用不明顯。當銨鹽與硝酸鹽物質的量之比為1∶8 時，產量最高達到812 IU/mL，與對照組相比增加35%。

在7 L 發酵罐中pH 的調控由全部使用氨水變為中后期氨水與2 mol/L NaOH 交替使用的策略，控制銨離子濃度在10 mmol/L 以下。發酵結束后，菌體濃度沒有明顯減少，而產量提高10%，達到5 292 IU/mL。