副豬嗜血桿菌lpxM基因缺失株構建及生物學特性分析

楊君，楚品品，宋帥，蔡汝健，楊冬霞，卞志標，勾紅潮，李艷，蔣智勇，李春玲，閆鶴

（1華南理工大學食品科學與工程學院，廣州 510640；2廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治重點實驗室/農業部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640）

0 引言

【研究意義】副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis，HPS）屬于巴斯德菌科、嗜血桿菌屬，短桿狀的革蘭氏陰性（G-）菌[1]。HPS感染者的癥狀是一系列炎癥反應，如多發性漿膜炎、關節炎、腦膜炎等[2-3]，使豬致病甚至死亡，死亡率可高達 50%[4]，每年給養豬業造成巨大損失。基于目前的血清分型方法可將HPS分成15個血清型，其中5型最普遍且表現高毒力[5-8]，證實HPS的毒力因子有外膜蛋白（Omp）、莢膜多糖（Cps）、脂多糖（LPS）、轉鐵蛋白、菌毛等[9]。LPS被證實是一種內毒素，能致使機體發炎，嚴重時可導致敗血癥[10]。LPS結構由三部分組成，即類脂A、核心多糖和O-抗原多糖[11-12]，HPS合成的LPS因缺少O-抗原多糖部分，也被稱為脂寡糖（LOS）[13]。而類脂A屬于LOS的活性部位，是以葡萄糖胺二糖為主體，上面含有多條酰基鏈，lpxM基因編碼形成豆蔻酰酰基鏈的轉移酶，屬于其潛在的毒力因子。雖然目前對HPS的毒力基因有一些研究，但對于其致病機制研究的還不夠透徹，進一步挖掘 HPS的毒力基因對深入研究其致病機制進而防控HPS感染具有重要意義。【前人研究進展】ANDREY[14]等研究對鼠疫桿菌 lpxM 基因缺失對其毒力和疫苗潛力影響，該基因缺失后阻斷了其合成六酰基化的類脂 A，在小鼠模型中驗證毒力和疫苗保護效力時發現，缺失株的LD50無變化，但其毒力有2.5—1.6倍的降低，免疫保護效力有明顯提高。HAUTEVILLE[15]等發現弗氏志賀菌的兩個 msbB（lpxM）基因對其介導的炎癥反應和破壞腸道的上皮細胞具有重要作用，將該基因鈍化后能減少刺激人單核細胞TNF-α的分泌和削弱對上皮屏障的炎癥破壞作用。XU[16]等研究了lpxM基因對禽致病性大腸桿菌毒力等一些生物學特性的影響，結果lpxM缺失對生長速率和對抗雞血清殺菌能力無影響，但對雞巨噬細胞系的入侵及存活能力顯著降低，動物試驗中也發現了缺失對動物器官的入侵能力降低，以上結果表明 lpxM 基因對細胞的毒力及其它生物活性具有一定的影響。目前，對HPS的LOS合成相關基因研究有很多，包括多糖合成相關基因galU和galE[4]、rfaD和rfaF[17]、lgtB和lex-1[13]、lgtF[18]、rfaE[19]等，這些基因的缺失對HPS的毒力、生長、生物被膜形成、血清抗性及對細胞的炎癥作用具有一定的影響。上述研究為lpxM基因缺失對HPS生物學功能影響奠定了基礎。【本研究切入點】雖然 lpxM 基因在對多數G-菌生物學特性特別是毒力具有一定影響，但該基因對HPS影響的研究未見報道，lpxM基因對HPS的生長、毒力等生物學特性的影響還未知，故需要對此展開研究。【擬解決的關鍵問題】驗證 lpxM 基因缺失對HPS的生長情況，生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力、對RAW264.7細胞毒力及對臨床上常用的13種抗生素和多粘菌素B敏感性部分生物學特性的影響，為研究lpxM基因的功能，揭示HPS的致病機制及開發HPS的基因工程弱毒疫苗奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種和載體

5型地方分離株副豬嗜血桿菌H45由廣東省農業科學院動物衛生研究所豬病研究室分離保存；大腸桿菌 DH5α感受態細胞購自北京鼎國生物科技有限公司；RAW264.7細胞、自殺載體PK18mobsacB和輔助質粒 pCas由廣東省農業科學院動物衛生研究所豬病研究室保存。本研究于廣東省農業科學院動物衛生研究所2019年上半年完成。

1.2 試劑、培養基和試劑盒

胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA）培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）培養基和結晶紫購至廣東環凱微生物科技有限公司；2×TaqPCRMaster Mix、T4DNA連接酶、DNA限制性核酸內切酶購于大連寶生物工程有限公司；卡那霉素（KanR）購自北京鼎國生物科技有限公司；細菌基因組提取試劑盒、質粒小提試劑盒、膠回收試劑盒及純化試劑盒購自美國OMEGA公司；細胞毒性LDH檢測試劑盒購自美國Promega公司；抗生素藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司。

1.3 引物

本研究所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 引物序列Table 1 Primers sequence

1.4 副豬嗜血桿菌缺失株的構建與鑒定

1.4.1 重組片段的制備 以副豬嗜血桿菌 SH0165（GenBank登錄CP001321.1）在NCBI上公布基因序列為參考，設計 lpxM基因上下游同源臂引物，并在上下游同源臂加上酶切位點和USS序列，以H45基因組為模板通過 PCR擴增上下游同源臂片段，質粒pCas為模板擴增卡那抗性表達盒，以這3個片段為模板通過重疊延伸PCR得到同源重組片段M-UKD。

1.4.2 重組質粒的構建 將同源重組片段 M-UKD和載體PK18mobsacB雙酶切，純化后用T4DNA連接酶過夜連接。將連接好的質粒熱擊轉化進大腸桿菌DH5α感受態細胞，并涂布于含有卡那霉素抗性平板的TSA平板（50ng·μL-1，下同）上，PCR和雙酶切測序鑒定重組質粒是否構建成功。

1.4.3 自然轉化法構建缺失株 利用構建好的重組質粒PKM-UKD自然轉化進H45構建lpxM基因缺失株，轉化方法參考文獻[4, 20-21]中構建HPS自然轉化法。其步驟大致如下：將轉化用的受體菌H45接種于TSA（含10%新鮮牛血清和0.1% NAD，下同）平板活化，37℃恒溫烘箱過夜培養。將過夜培養的菌用3 mL TSB洗下，調整其OD600為0.9—1.0。取20 μL菌液于 1.5 mL EP 管中，加入 20 μL cAMP(8 mmol·L-1)作用10 min，然后加10 μL（約1μg）質粒，混勻后作用10 min；同時以10 μL無菌水與細菌混勻，作為陰性對照。把作用后的菌與質粒混合物轉移到TSA平板上，直徑約1 cm，平皿正置于37℃培養5 h后用200 μL TSB洗滌菌體并涂布于含卡那霉素的TSA抗性平板上，37℃倒置培養得到轉化子，PCR鑒別是否發生了 lpxM基因的缺失。

1.5 缺失株與野生株生長情況比較

挑取活化的基因缺失株 H45-△lpxM和野生株H45于5 mL含相應抗性的TSB培養基中，37℃，220 r/min培養12 h左右，利用紫外分光光度計調節兩株菌的OD600值保持一致；按1﹕100的比例轉接至200 mL含相應抗性的TSB培養基中，連續培養16 h，每間隔1 h測定其OD600值，繪制時間t-OD600的曲線。

1.6 缺失株與野生株生物被膜形成能力比較

生物被膜形成能力比較參考文獻[1, 4]，做一定修改。準備潔凈玻璃試管分成3組，1組空白組和2組試驗組，每組3根試管，每支玻璃試管中加入 3 mL TSB，試驗組中每個試管中各加入60μL的H45或H45-△lpxM，空白組只加培養基，將試管靜置于37℃培養箱中靜置培養 24h，移除菌液并用蒸餾水輕輕沖掉游離菌體，室溫下用3 mL 1%的結晶紫溶液染色5—10 min后用流水輕緩沖洗至少3次，至沖洗液變為無色為止，將試管倒置晾干后觀察結果（拍照），每根試管用1 mL 33%（v/v）醋酸溶解，并630 nm波長下測定吸光度。

2003 年，Cousin 等[9]將 ASCs 注入骨髓功能缺失的小鼠體內，發現其造血及淋巴系細胞的生成得以恢復，并在體外實驗中促進髓系細胞分化。此后，大量研究證實 ASCs 主要通過細胞間接觸作用于多種免疫細胞并調控免疫分子，發揮復雜的免疫調節功能并總體起到劑量依賴的免疫抑制作用 [10]。

1.7 缺失株與野生株抗血清殺菌能力比較

抗血清殺菌試驗參考文獻[22]，方法如下：血清來源于3—4周齡未感染HPS的健康小豬，血清過0.22 μm濾膜除菌，置于-80℃保存。取部分血清于56℃水浴鍋滅活補體30 min，得到滅活血清。取100 μL滅活或沒滅活血清分別與 100 μL 菌液（107—108cfu·mL-1）混合（菌液﹕血清=1﹕1），37℃，150 r/min振蕩培養1 h，梯度稀釋涂布平板進行計數，每個樣本設置3個平行。

1.8 缺失株與野生株對RAW264.7細胞毒性比較

RAW264.7細胞培養至良好狀態后轉移到96孔板中（105Cells/孔）培養過夜，第二天分別用H45或H45-△lpxM（MOI=10， 106cfu/孔）刺激，不加菌作為陰性對照，作用時間為6、12和24 h，每個時間點收取細胞上清液并使用 LDH檢測試劑盒進行細胞毒性檢驗，每組做3個平行。

1.9 缺失株和野生株對抗生素敏感性比較

使用 Kirby-Bauer 紙片擴散法（K-B法）進行抗生素敏感性試驗[23-24]。本試驗使用的抗生素為臨床上常用的13種抗生素及多粘菌素B，分別為氨芐西林、阿莫西林克拉維酸、頭孢噻吩、頭孢氨芐、頭孢唑林、頭孢拉定、頭孢噻肟、慶大霉素、多西環素、磺胺二甲異噁唑、氟苯尼考、阿莫西林、恩諾沙星。實驗步驟為，菌液復蘇和傳代，涂板、貼藥敏片，37℃倒置18—24 h，讀取抑菌圈直徑，每個藥敏片做3個平行，耐藥結果根據藥敏標準判定。

1.10 數據處理與分析

Word和 Excel軟件用于數據的初步統計以及作圖，統計學分析和作圖使用GraphPad Prism 7。

2 結果

2.1 重組片段的擴增

以H45基因組為模板，PCR擴增lpxM基因上游同源臂（489 bp）、下游同源臂（593 bp），以pCas為模板，PCR擴增卡那抗性表達盒（909 bp），重疊延伸PCR將上游、卡那抗性表達盒、下游同源臂連接得到重組片段M-UKD（1 991 bp，圖1）。

2.2 重組質粒的構建

將 M-UKD和 PK18mobsacB雙酶切后過夜連接，轉化 DH5α，挑取抗性平板上長出的單菌落搖菌，小提質粒進行雙酶切鑒定，得到1 991 bp的重組片段M-UKD和5 719 bp的載體片段（圖2），將酶切的片段進行測序，將測序結果與目的序列進行比對無誤后確定 lpxM 基因的重組質粒構建成功，命名為PKM-UD。

圖1 重組片段的構建Fig.1 Construction of recombinant fragments

圖2 重組質粒PKM-UKD雙酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant plasmid PKM-UKD by double enzyme digestion

2.3 缺失株的鑒定

利用 3對引物對抗性平板上長出的轉化子進行PCR鑒定，以構建好的重組質粒為陽性對照，鑒別其是否發生了目的片段的缺失（圖 3）。第 1對引物lpxM-up-EcoRI-F/lpxM-down-PstI-R進行擴增，H45擴增得到1 622 bp的條帶，H45-△lpxM擴增得到1 991 bp的條帶，說明909 bp的卡那抗性表達盒替代了lpxM基因的540 bp部分片段，H45發生了lpxM基因部分片段的缺失；第2對引物kanR-F/R擴增，H45擴增不到條帶，而H45-△lpxM擴增得到909 bp的條帶，說明卡那抗性表達盒整合到染色體上；第 3對引物sacB-F/R進行鑒定，兩者均不能擴增到條帶，說明質粒在缺失株內發生消除。最后，用引物HPS-F/R鑒定該缺失株是否為HPS，結果顯示可擴到條帶（圖4），說明在卡那抗性平板上長出的轉化子是HPS。結果表明關于H45的lpxM基因部分片段缺失的缺失株H45-△lpxM已經構建成功。

圖3 lpxM基因缺失株的鑒定Fig.3 Identification of the lpxM gene deletion strain

2.4 lpxM基因缺失對HPS生長的影響

2.5 lpxM基因缺失對HPS生物被膜形成的影響

圖4 鑒定是否為HPSFig.4 Identification of the HPS

圖5 野生株和缺失株的生長曲線Fig.5 Growth curves of wild and deletion strains

生物被膜形成能力的結果如圖6，從左到右依次是H45、H45-△lpxM和空白對照靜置培養24 h后生物被膜產生的情況，圖6中顯示缺失株產生的生物被膜弱于野生株H45。測定OD630值（圖7），H45的OD630值為0.237，而H45-△lpxM只有0.173，說明lpxM基因的缺失使得H45生物被膜形成的能力減弱。

2.6 lpxM基因缺失對HPS血清抗性的影響

如圖 8，H45在缺失 lpxM基因后在 50%的豬血清中存活能力顯著降低，由16.1%降到了0.71%，說明缺失該基因后導致 H45抵抗血清補體殺菌能力降低，lpxM基因可能與HPS抗血清殺菌的能力相關。

2.7 lpxM基因缺失對HPS致細胞毒性的影響

結果如圖9，H45和H45-△lpxM刺激RAW264.7細胞后均能引起細胞死亡，作用時間為6、12和24 h，H45對細胞的致死率分別為 6.63%、10.86%和22.17%，H45-△lpxM對細胞的致死率分別為2.62%、6.35%和18.01%，隨著作用時間的延長，兩者對細胞毒性越來越大，但在3個時間點H45-△lpxM對細胞的毒性均低于H45，說明lpxM基因可能與HPS毒力相關。

圖6 生物被膜形成Fig.6 Biofilm formation

圖7 生物被膜OD630值Fig.7 Biofilm OD630 value

圖8 血清存活能力Fig.8 Survival of HPS treated with porcine serum

圖9 細胞毒性試驗Fig.9 Cell cytotoxicity test

2.8 lpxM基因缺失對抗生素敏感性影響

H45和H45-△lpxM對13種臨床上常用抗生素和多粘菌素B的藥敏結果如表2，兩者均對頭孢噻吩等10種抗生素和多粘菌素B表現敏感，但是抑菌圈直徑存在一定的差異，大多數抗生素后者的抑菌圈要大于前者，說明后者對抗生素的敏感性更高，對氨芐西林、阿莫西林克拉維酸和磺胺二甲異噁唑這 3種抗生素，兩者的敏感性有較大差異，缺失lpxM基因后，菌株對氨芐西林的耐藥性由中介（I）變成敏感（S），對阿莫西林克拉維酸和磺胺二甲異噁唑由耐藥（R）變成了敏感（S），說明lpxM基因對H45的抗生素耐藥性具有一定的影響，但具體機制還需要進一步研究。

表2 藥物敏感性結果（抑菌圈直徑mm）Table 2 Results of drug sensitivity (antimicrobial zone diameter mm)

3 討論

血清5型的HPS屬于強毒株，能引起豬產生一系列炎癥反應甚至死亡。LOS是 HPS的一個毒力因子，而類脂 A是 LPS活性部位，其結構影響著LOS的毒力[13]。類脂A是以葡萄糖胺二糖為主體，含有多條酰基鏈和磷酸基團，而 lpxM基因編碼的酰基轉移酶LpxM負責類脂A合成的最后一步，即將豆蔻酰（C14）酰基鏈連接到葡萄糖胺二糖 3′-位點上，得到完整結構的類脂A[16,25]。類脂A上酰基鏈的數量影響LOS的結構，繼而影響其毒力。本研究以自殺性質粒 PK18mobsacB為載體構建了關于lpxM基因缺失的重組質粒，通過將重組質粒自然轉化進HPS得到基因缺失株，繼而比較了缺失株和野生株的生長情況、生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力、對RAW264.7細胞毒力作用和對部分抗生素的敏感性。

通過生長曲線的測定，發現8 h前缺失株生長速度明顯慢于野生株，7 h時野生株的OD600為0.8223，H45-△lpxM只有0.5473，8 h之后野生株和缺失株生長情況達到一致。前期明顯慢于野生株，后期達到一致，說明lpxM基因的缺失對H45的生長情況具有一定影響，該基因的缺失影響 LOS合成繼而導致 HPS生長變慢，這也與大腸桿菌 lpxM 基因缺失后生長情況變化情況一致[25]。

生物被膜形成的能力能反映菌株毒力，生物被膜產生能力越強可認為菌株毒力越強，生物被膜能幫助細菌抵御不良的環境的危害，使其逃逸于宿主的免疫系統和抗生素的作用，最終導致其抵抗能力增強[26]。目前的研究證明影響 HPS生物被膜形成能力的基因有vacJ[27]、galU和galE[4]等，本研究首次證實lpxM基因與HPS生物被膜形成的能力相關，該基因的缺失導致能力減弱。

血清抗性在HPS先天性免疫防御中發揮巨大作用，被認為是HPS的一個毒力機制，LOS和多糖的合成蛋白CapD參與其對血清補體的抗性[28-29]。根據之前的研究證實 HPS的lgtB和lex-1[13]、galU和galE[4]等基因對其抗血清殺菌具有一定影響，本研究也初步證實lpxM基因對HPS在50%豬血清中的抗性具有一定影響，該基因缺失能降低其在血清中的存活能力。

細胞毒性可能不是 HPS用來增加血腦屏障通透性的機制，HPS和其分泌的 LOS均不能對豬腦微血管內皮細胞（PBMEC）產生毒力[30-31]。而本研究結果表明HPS對RAW264.7細胞具有一定的毒力，并且缺失LOS合成的相關基因lpxM后，對細胞的毒力降低，說明LOS合成的相關基因lpxM對 HPS的毒力具有一定影響，但具體機制還需要進一步研究。

lpxM基因是關于類脂A合成的最后一步基因，而類脂A是細胞膜的主要組成部分，多粘菌素B的作用機制是破壞細菌細胞膜的磷脂結構[25]。HPS防治的過程使用大量抗生素，導致耐藥性產生。本研究展示lpxM基因缺失對臨床上常用的13種抗生素和多粘菌素B的影響，缺失該基因對各種抗生素敏感性提高，部分抗生素從耐藥變成敏感，結果與文獻[16, 25]中lpxM 基因缺失導致大腸桿菌對一些抗生素敏感性提高的結果一致，說明 lpxM 基因可能與菌株對部分抗生素的敏感性相關。

4 結論

本研究成功構建HPS的5型地方分離株H45的lpxM 基因缺失株，通過部分生物學特性比較結果顯示，lpxM基因缺失對 HPS 生長速度具有一定影響，生長前期抑制其生長，降低其生物被膜形成能力、抗血清殺菌能力和對RAW264.7細胞毒力，提高對氨芐西林等多種臨床上常用抗生素和多粘菌素 B的敏感性，對少量的抗生素敏感性甚至發生變化，從耐藥變成敏感，這些研究結果對進一步探究 lpxM 基因功能及揭示 HPS的致病機制和相關基因的弱毒疫苗開發提供一定的科學試驗依據。