小麥、玉米兩熟區小麥紋枯病菌群體組成及其農田分布特征

趙緒生，齊永志,2，甄文超

（1河北農業大學植物保護學院，河北保定 071001；2省部共建華北作物改良與調控國家重點實驗室，河北保定 071001；3河北農業大學農學院，河北保定 071001；4河北省作物生長調控重點實驗室，河北保定 071001）

0 引言

【研究意義】由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）或立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）引起的小麥紋枯病（wheat sharp eyespot，WSE）是一種世界性土傳病害，20世紀80年代初在北美洲和歐洲小麥產區嚴重發生[1]。進入21世紀以來，隨著氣候變暖、秸稈還田以及氮肥用量提高，加之小麥紋枯病抗性品種匱乏，造成該病害已成為中國黃淮海小麥、玉米兩熟區的小麥主要病害，嚴重影響了小麥的優質高產[2]。據統計，近十年來，小麥紋枯病在河北、河南和山東等省麥區每年發生總面積高達420萬公頃以上，一般發病地塊減產5%—30%，嚴重地塊減產超過50%[3-5]。自2012年，小麥紋枯病成為河北省僅次于白粉病的第二大病害[4]。調查河北、山東、河南麥區紋枯病發生程度，探析3省不同生態類型區小麥紋枯病菌的群體差異及優勢病原菌在小麥-玉米秸稈還田種植體系中的分布特征，對該病害的科學防控具有重要意義。【前人研究進展】已有研究表明，中國小麥紋枯病菌的優勢菌群多為禾谷絲核菌，其中，以CAG1（AG-D）、CAG-3、CAG-6、AGC1菌絲融合群為主[6-11]。李海燕等[3]研究發現，2014年采自河北省3個不同生態類型麥區的196株紋枯病菌包括 AG-D、AG-B (0)、AG-I、AG-5和AG-4 5種融合群，且以強致病力AG-D融合群為主；汪敏等[12]研究表明，2011年采自河南周口等13個地區的157株紋枯病菌包括156株雙核絲核菌AG-D融合群和1株雙核絲核菌為AG-B (0)融合群；于金鳳等[13]研究發現，2002年采自山東麥區的55株紋枯病菌中有54株為雙核絲核菌AG-D融合群。汪敏等[12]根據標準菌株致病力強弱，將采自河南省13個麥區的119株菌株劃分為強、中等和弱致病力3種類型；李海燕等[3]根據196株分離所得菌株及6株標準致病力菌株接種3個小麥品種后的平均病情指數，可將202株菌株劃分為極強、強、中等和弱4種致病力類型；杜文珍[14]從江蘇等5省麥區分離鑒定的237株雙核絲核菌株中，強致病力和弱致病力菌株數僅分別為 46株和30株；陳瑩等[15]明確了中國北緯33°地區小麥紋枯病菌約96%菌株均屬于強致病力AG-D融合群，但不同地區菌株間的致病力均無顯著差異。【本研究切入點】受長期少免耕和秸稈還田、小麥種子異地調運以及農機跨區作業等影響，當前河北、山東、河南麥區小麥紋枯病的病原菌群體組成、致病力差異需要系統調查；同時，小麥紋枯病菌強致病力優勢菌群在中國北方小麥、玉米兩熟區農田中的分布特征也未見報道。【擬解決的關鍵問題】調查河北、山東、河南 3省小麥、玉米兩熟區小麥紋枯病的發生程度，通過細胞核染色、菌絲融合反應和rDNA-ITS序列分析鑒定病原菌群體特征，分析優勢病原菌禾谷絲核菌的菌株間致病力差異及其在小麥、玉米兩熟秸稈還田種植體系中的分布特征。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥品種：石新 828（冀審麥 2005004）、濟麥22（國審麥2006018）、周麥22（國審麥2007007），均為河北、山東、河南麥區種植的小麥主推品種，對小麥紋枯病抗性表現分別為高感、中感和感病。

小麥紋枯病菌菌絲融合群標準菌株：AG-D（CAG1）、AG-E、AG-B (0)和AG-Ba為禾谷絲核菌；AG-5和AG-2為立枯絲核菌，由河北省農林科學院植物保護研究所孔令曉研究員提供。

禾谷絲核菌致病力標準菌株：R0301、C16、R8433為強致病力菌株，R8401為中致病力菌株，R8406、D32為弱致病力菌株，由江蘇省農業科學院陳懷谷研究員提供。

1.2 方法

1.2.1 小麥紋枯病樣品采集與病害調查 2017—2018年，在小麥拔節至孕穗期，選取河北（黑龍港平原、山前平原和冀東平原）[3]、山東（山東半島、中部、西北部和西南部）[16]、河南（南部、北部、中南部和中北部）[17]11個不同生態類型麥區72個采樣點（秸稈還田均15年以上）為檢測點，每檢測點隨機選5塊樣田（約90 m2/塊），采用5點取樣法，每點從1.1 m雙行中選30個莖，按照小麥紋枯病成株期分級標準調查小麥紋枯病發病情況，計算病情指數；同時，采集小麥紋枯病組織樣品，低溫保存帶回實驗室。小麥紋枯病成株期分級標準：0級：無癥狀；1級：葉鞘有病斑，但未侵入莖稈；3級：病菌侵入小麥莖稈，病斑寬度環繞莖稈長度未長于莖稈周長1/2；5級：病斑環繞小麥莖稈長度達周長 1/2—3/4；7級：病斑環繞小麥莖稈周長3/4以上；9級：形成小麥枯孕穗或白穗[9]。

1.2.2 小麥紋枯病菌分離與鑒定 小麥紋枯病病原菌分離純化與初步鑒定：無菌條件下剪取樣品病健交界處組織塊（2.0 mm×2.0 mm），表面消毒后轉移至含鏈霉素和利福平的PDA培養基，25℃黑暗培養5 d后單菌絲頂端分離、純化、保存，根據病菌形態學特征進行初步鑒定。

供試菌株與融合群標準菌株的融合情況[18]：采用對峙培養法判定，將供試菌株與標準菌株同時打取菌餅后，接種于載玻片上，25℃黑暗保濕對峙培養（相距2 cm）。每菌株3次重復，每皿1個菌餅。當菌絲生長至相互接觸時，用番紅O-KOH染色液染色5 min后，蓋上蓋玻片在顯微鏡下觀察菌絲細胞的融合情況和細胞核數目。

小麥紋枯病病原菌分子鑒定[19]：采用CTAB法提取菌株基因組DNA，采用真菌rDNA-ITS PCR擴增通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增待測菌株DNA序列片段。PCR擴增產物測序后，在NCBI中進行BLAST序列比對。

1.2.3 小麥紋枯病菌致病力測定 接菌體的制備：先于PDA培養基上活化不同生態類型區選出的120個供試禾谷絲核菌菌株（隨機選40株/區）和6個標準致病力菌株，然后將10個直徑5 mm紋枯病菌菌餅接種至含有80 g無菌麥粒的200 mL三角瓶中，25℃黑暗培養。培養期間每2 d搖勻1次，每供試菌株接種3瓶。40 d后得麥粒接菌體，直接粉碎后過20目篩，備用。

菌株致病力測定：小麥種子經1% HgCl2表面消毒5 min后[20]，用無菌水沖洗3次，置于鋪有3層濕潤紗布的培養皿中，28℃黑暗保濕催芽，露白后播入裝有0.5 kg滅菌土（121℃，間歇濕熱滅菌3次，每次45 min，間隔時間3.5 h）直徑為12 cm的營養缽中，每缽20粒；種子周圍勻撒0.8 g接種體，表面覆蓋3 cm厚滅菌土。以未接菌粉碎麥粒為對照。每供試菌株接種3個小麥品種，每品種3次重復，每重復6缽。25℃、14 h﹕10 h（光﹕暗）條件下培養，30 d后，參考汪敏等[12]的小麥幼苗分級標準調查發病情況：0級：無癥狀；1級：外層葉鞘變褐或有明顯的紋枯病斑，但病斑直徑小于葉鞘周長的1/2；3級：外層葉鞘有明顯的紋枯病斑，病斑直徑大于葉鞘周長的1/2，但內層葉鞘無癥狀；5級：內層葉鞘變褐或有明顯的紋枯病斑，但病斑直徑小于葉鞘周長的1/2；7 級：內層葉鞘有明顯的紋枯病斑，病斑直徑大于葉鞘周長的1/2，但植株不死苗：9級：植株死苗。

1.2.4 小麥、玉米兩熟秸稈還田種植體系中禾谷絲核菌的檢測 試驗田基本情況：2017年10月至2018年10月，選擇河北省保定市望都縣河北農業大學實驗基地（小麥品種為良星99）、山東省德州市樂陵市辛莊村（小麥品種為濟麥22）、河南省洛陽市偃師市龐村（小麥品種為周麥22）作為檢測點，各點均采用小麥、玉米兩熟種植制度，已連續17年秸稈全量還田，小麥紋枯病歷年發病率≥50%。每個試驗基地均為沙壤土，肥力中等。0—20 cm耕層土壤pH 7.0。按常規生產方法進行栽培管理。

小麥、玉米生長季取樣：（1）植株組織。采用隨機5點取樣法采樣，在小麥三葉期、分蘗期、越冬期、返青期、起身期、拔節期、抽穗期，每點各取10株；在玉米三葉期、拔節期、大喇叭口期、抽雄期、乳熟期，每點各取3株；小麥、玉米整株樣品（地上部和0—20 cm根系）置于低溫冰盒中帶回實驗室，并于-20℃保存；（2）根際土壤。分別在小麥、玉米關鍵生育期（同1）采集根際土壤樣品，采用大田挖掘法5點取樣[21]，每點選擇連續10株小麥、3株玉米，挖取0—40 cm土層的根系，輕輕抖去根系上脫落的土壤，保留附著于根的根際土壤，并及時放入無菌袋中混勻后，置于低溫冰盒中帶回實驗室，于-20℃保存，用于禾谷絲核菌的定量測定。

植株組織和土壤樣品中禾谷絲核菌實時熒光定量PCR檢測：植物組織整株樣品經粉碎后，分別用土壤和植物組織DNA提取試劑盒（型號分別為DP305和DP336，天根生化科技有限公司）提取禾谷絲核菌DNA，每份（1.0 g）土壤、組織樣品分別提取份3份，提取方法按說明要求并稍作調整。禾谷絲核菌特異性引物為 RtubF4（5′-CCTAAATGAGTCTGGAGTAAGT C-3′）和 RtubR4（5′-GCTAGTGCGGTCAATGTATA G-3′）[22]，由上海生工生物工程有限公司合成。熒光定量 PCR 體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TapTM（2×）10 μL，上游引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，下游引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX reference dye（50×）0.4 μL，DNA模板2.0 μL，ddH2O 6.8 μL。熒光定量檢測使用美國應用公司ABI StepOne熒光定量PCR儀，擴增程序[23]：95℃預變性 30 s，95℃變性 5 s，60℃退火 30 s，40個循環，熔解曲線分析：95℃ 0 s，60℃ 1 min，然后以 0.3℃·s-1升至 95℃。以禾谷絲核菌 BD-14的DNA 為標準品進行梯度稀釋（1.0×10-6—1.0×102ng·μL-1），經熒光定量檢測后，以 DNA 起始濃度的對數值為x軸，以Ct值為y軸構建標準曲線。以梯度稀釋的土壤和組織樣品的 DNA為模板，進行擴增檢測，根據標準曲線，得到待測樣品Ct值，即可獲得對應DNA樣品的濃度值。

1.2.5 數據統計與分析 根據所測定數據，對比分析11個不同生態類型麥區小麥紋枯病發生程度差異、紋枯病菌致病力差異及優勢病原菌禾谷絲核菌在小麥-玉米秸稈還田種植體系的農田分布特征。用 Excel 2010和DPS 7.0軟件對試驗數據進行統計分析，采用Duncan’s新復極差法比較菌株致病力差異，采用非加權配對算術平均法對病菌致病力進行聚類分析[20]。

2 結果

2.1 河北、山東和河南不同生態類型區小麥紋枯病發病程度

由表1可知，2017—2018年3省11個生態類型區小麥紋枯病均有發生。省際間比較，發病程度由重到輕依次為河南、山東和河北。河南4個生態類型區小麥紋枯病發病率均在38.7%以上，各區差異不顯著，但北部麥區病情指數顯著低于南部、中南部；山東西南部麥區紋枯病發病率為38.1%，顯著高于山東半島、西北部，但該區病情指數與山東半島麥區無顯著差異；河北省黑龍港平原麥區紋枯病發病最重，發病率和病情指數分別為32.7%和10.8，均顯著高于山前平原和冀東平原。

2.2 不同生態類型區小麥紋枯病菌菌絲融合群種群分布

從11個不同生態類型麥區72個采樣點采集的小麥紋枯病株中，分離、純化出445個菌株，其中河北、山東、河南麥區分別為179、149和117株。通過番紅 O-KOH染色、菌絲融合和分子鑒定（相似性比對均在98%—100%），表明這些分離物分別屬于具有雙核的禾谷絲核菌（421個）和多核的立枯絲核菌（24個），分別占分離總數的 94.61%和5.39%，菌株菌絲融合群分屬AG-D、AG-B (0)、AG-2和AG-5 4個融合群（表2、圖1），各融合菌群菌株數量分別為409、12、17和7株，占比91.91%、2.70%、3.82%和1.57%。

表1 不同生態類型區小麥紋枯病的發生程度Table 1 Incidences of wheat sharp eyespot in different ecological regions

圖1 小麥紋枯病菌菌核數量及菌絲融合反應類型Fig.1 Number of nucleolus and types of hyphal anastomosis reaction of Rhizoctonia strains on wheat

2.3 不同生態類型區禾谷絲核菌致病力差異

對120個禾谷絲核菌菌株在3個小麥品種上進行了致病力測定，結果表明采自河北麥區的禾谷絲核菌對石新828和濟麥22的致病力無顯著差異，但顯著強于在周麥22上的致病力；接種采自山東麥區的禾谷絲核菌后，石新828的病情指數顯著高于另外2個供試品種；采自河南麥區的菌株對3個小麥品種致病力由強到弱依次是石新828、濟麥22和周麥22（表3）。綜合對比，采自河南的禾谷絲核菌致病力顯著強于山東和河北麥區，河北麥區菌株致病力最弱。

2.4 不同生態類型區禾谷絲核菌致病力區域特征

對120個禾谷絲核菌菌株和6株致病力標準菌株在石新828、濟麥22和周麥22 3個小麥品種上的致病力進行了聚類分析，結果表明（圖2），河北、山東、河南麥區禾谷絲核菌致病力由強到弱依次可劃分為VT1、VT2、VT3、VT4和 VT5 5個致病力類型（d=2.37），平均病情指數分別為44.0、39.4、34.2、29.6和27.2；各類型中供試病原菌菌株數分別有7、50、41、18和4株。

最強致病力VT1類型中僅有山東西南部3個菌株和河南南部4個菌株；VT2類型中包括河南28個（南部、中南部和中北部分別8、11、9個）、山東12個（中部、西南部各6個）和河北10個（黑龍港平原、山前平原分別8、2個）；VT3類型中包括河南12個（北部、中北部分別為9、3個），山東10個（中部、西北部各5株），河北19個（黑龍港平原、山前平原、冀東平原分別3、10、6個）；VT4類型中包括河南2個（北部）、山東12個（西北部、山東半島分別10、2個）、河北4株（冀東平原）；VT5類型中僅包括山東4個（西北部）。

表2 不同生態類型區445株小麥紋枯病菌分布及其細胞核數量Table 2 Nucleolus number and distribution of 445 Rhizoctonia strains on wheat in different ecological regions

圖2 隨機選取不同生態類型區55株禾谷絲核菌對石新828、濟麥22和周麥22致病力聚類分析Fig.2 Clustering analysis of the pathogenicity of 55 R. cerealis strains collected from 11 ecological regions to Shixin 828, Jimai 22 and Zhoumai 22

2.5 小麥、玉米兩熟秸稈還田種植體系中禾谷絲核菌的分布特征

河北、山東和河南小麥、玉米兩熟秸稈還田種植體系中，小麥季禾谷絲核菌在地上部組織、根系和根際土壤中的分布差異較大（圖3-A）。隨著生育進程，小麥地上部組織和根系中的禾谷絲核菌 DNA含量均呈先升高、后降低的趨勢。地上部植物組織中病原菌菌量在起身期含量最高，達3 774.6 ng DNA/g鮮組織；與三葉期相比，分蘗期菌量增長幅度最高，為 28.17倍，其次是起身期。根系中的含菌量在拔節期最高，為193.1 ng DNA/g鮮組織；與三葉期相比，其分蘗期含菌量增長幅度也最高，達17.26倍。而3省根際土壤中的平均菌量呈逐漸升高的趨勢，在抽穗期最高達309.0 ng DNA/g干土。

圖3 小麥、玉米兩熟區小麥季（A）和玉米季（B）禾谷絲核菌農田分布特征Fig.3 Distribution characteristics of R.cerealis in wheat (A) and maize (B) double cropping system

表3 不同生態類型區120株禾谷絲核菌對3個小麥品種的致病力Table 3 Pathogenicity of 120 R. cerealis strains collected from the different ecological regions on three wheat cultivars

圖3-B為玉米季禾谷絲核菌在地上部組織、根系和根際土壤中的分布情況。隨著生育進程，玉米地上部組織中禾谷絲核菌 DNA含量逐漸升高，河北、山東乳熟期達到最高，分別為1 245.4、2 047.6 ng DNA/g鮮組織，河南在抽雄期達最高，為1 846.3 ng DNA/g鮮組織；與三葉期相比，拔節期和大喇叭口期菌量增長倍率均在6.0倍以上。根系中的菌量在玉米季變化幅度較小，在10.5—73.7 ng DNA/g鮮組織。根際土壤中的菌量基本呈現降低趨勢，抽雄期最低為170.6 ng DNA/g干土，乳熟期略有增長。

3 討論

從河北、山東和河南小麥、玉米兩熟秸稈還田的11個不同生態類型區分離獲得的445株小麥紋枯病菌中，強致病力 AG-D（CAG1）融合群占 91.91%。此結果與已有報道基本一致，如 2011年，汪敏等[12]發現河南麥區紋枯病菌AG-D融合群占比高達99.36%；李海燕等[3]研究證明，雙核絲核菌占河北省小麥紋枯病菌群體的89.8%，AG-D和AG-B (0)各占88.3%和1.5%，另外，還鑒定出部分AG-I、AG-4融合群；而李永娟等[24]從河北麥區分離的小麥紋枯病病菌僅包括雙核禾谷絲核菌AG-D融合群；于金鳳等[13]分離的55株山東小麥紋枯病菌中 AG-D融合群占比高達98.2%。本研究中未檢測到已報道過的部分多核絲核菌（AG-4融合群），究其原因可能是樣本采集樣點或樣品數量不同所致；亦有可能是病菌在適應小麥、玉米長期秸稈還田耕作條件過程中，病菌群體構成發生了微小變化。經SPSS統計軟件K-S檢驗發現，隨機選定河北、山東和河南不同生態類型麥區120株禾谷絲核菌的致病力強弱參數（3個小麥品種平均病情指數）的均值、標準差、Z值分別為36.3、3.97、0.623，P值（sig 2-tailed）=0.832＞0.05，數據呈正態分布，基本可代表河北、山東、河南麥區禾谷絲核菌的整體特征。石新828、濟麥22和周麥22對紋枯病的抗性分別表現為高感、中感和感病。但接種河北麥區禾谷絲核菌后，石新828與濟麥22病情指數差異不明顯；接種山東麥區禾谷絲核菌后，濟麥22和周麥22病情指數差異也不明顯。上述結果可能是因不同小麥品種紋枯病的室內抗性與田間抗性表現略有差異所致。

在不同致病力類型群體中，較強致病力VT1、VT2類型中河南、山東和河北麥區分別有32、15和10株，中間致病力VT3、VT4類型中河南、山東和河北麥區分別有14、22和23株，而弱致病力類型中僅包括山東地區4株。由菌株群體致病力聚類分析發現，河南麥區禾谷絲核菌群體致病力明顯強于山東麥區和河北麥區，強致病力菌株數量也較多。河南麥區該類強致病力菌株數量多以及小麥紋枯病抗性品種的匱乏，可能是該區紋枯病發生較重的主要原因。接種山東半島、山東西北部麥區菌株后3個小麥品種平均病情指數均顯著低于接種西南部麥區菌株病情指數；采自河北麥區菌株平均致病力由強到弱為黑龍港麥區＞山前平原＞冀東平原麥區。因此，導致山東西南部麥區紋枯病發生程度明顯重于山東半島、西北部麥區，河北黑龍港麥區發生程度明顯重于山前平原、冀東平原麥區的主要原因可能是各區菌株致病力差異所致。此外，河南、山東和河北各生態類型區禾谷絲核菌或立枯絲核菌菌株之間的遺傳多樣性也需要進一步研究。

作物病害的發生程度與病原菌致病力強弱、環境中的菌量及增殖速度緊密相關。研究致病菌在農田中分布特征，對探明土傳病菌致病機理及制定科學防控措施具有重要作用[25-26]。王建明等研究發現，尖鐮孢（Fusarium oxysporum）菌絲在西瓜和棉花地上部植株體內的相對含量和枯萎病發病程度呈顯著正相關[27-28]。本研究通過對河北、山東和河南麥區定位檢測發現，從三葉期至分蘗期，小麥植株體內禾谷絲核菌菌量增幅近30倍，在全生育期中增速最快；根系中菌量增幅度也高達17倍。本研究室前期研究發現，冬小麥、夏玉米一年兩熟秸稈還田土壤中含有機酸、酯、烴、酰胺及醛類等化學物質，有機酸類物質相對含量最高，達29.98%；且其中的3-(4-羥基-3-甲氧基苯基)-2-丙烯酸和4-甲氧基鄰氨基苯甲酸對禾谷絲核菌菌絲生長和菌核形成均具有顯著促進作用[29]。因此，從三葉期至分蘗期禾谷絲核菌增速較快的原因可能與玉米秸稈腐解物中的酸類物質密切相關。對于生產中有紋枯病發病史的麥區，在分蘗期就應加強紋枯病監測和防控；其次，還田秸稈作為主要病殘體始終存在于小麥、玉米兩熟周年種植體系中，所以田間麥玉秸稈粉碎還田時也應該注重化學或生防藥劑處理。在起身期至抽穗期，小麥植株體內的禾谷絲核菌含量呈明顯下降趨勢，可能是由于該階段小麥植株生物量增速加快或莖稈硬度增強影響了病菌在植株體內擴展。玉米全生育期植株體內菌量相對較低可能主要因為是禾谷絲核菌對玉米的侵染力較弱造成的。

4 結論

河南麥區紋枯病發生程度最重，山東麥區次之，河北麥區最輕。強致病力雙核禾谷絲核菌為3省優勢病原菌。采自河南麥區菌株整體致病力最強，河北麥區最弱。禾谷絲核菌菌量在小麥三葉期至分蘗期增速最快，在小麥秸稈中相對含量最高、玉米秸稈中最低。生產中可有針對性的在還田秸稈粉碎過程中與冬前小麥幼苗期加強紋枯病的監測與防控。