30%咪鮮·氟環唑微乳劑高效液相色譜分析

曹志秀，馬 超，張力卜，段小莉，李佳浩，張彥輝，徐 軍，2*，陳 昶，2*

（1.河北中保綠農作物科技有限公司，北京 100193；2.中國農業科學院植物保護研究所，北京 100193）

咪鮮胺（prochloraz）是一種咪唑類廣譜殺菌劑，通過干擾菌體麥角甾醇的生物合成過程中的C14脫甲基反應而發揮作用[1]，尤其對由子囊菌和半知菌引起的多種作物病害防效顯著，可用于治療和鏟除由核盤菌屬、鐮孢屬及白粉菌、炭疽菌等多種致病菌引起的油料作物、谷類、水果、蔬菜及經濟作物的病害[2]，其高防效、高穩定性及作物安全性受到了農民的青睞。

氟環唑（epoxiconazole）是一類兼具保護和治理作用的新一代三唑類殺菌劑，具有較強的內吸性[3]，可迅速被植株吸收并傳導至感病部位，阻止病害的侵染，其作用機理是通過抑制病菌麥角甾醇的合成，從而阻礙病菌細胞壁的形成致使病菌死亡[4]。該藥不僅有良好的鏟除活性，持效性長[5-6]，還有誘導作物提高自身抗病性的作用[7]。

咪鮮胺和氟環唑進行復配可以提高藥效，抑制由單一類型殺菌劑導致的抗病性的發展。30%咪鮮·氟環唑微乳劑（商品名：鮮行者）是一種新型復配殺菌劑，能有效防治水稻紋枯病。目前關于咪鮮胺和氟環唑單劑的檢測方法國內外已有諸多報道，其中咪鮮胺單劑主要分析方法有HPLC[2]、GC-ECD和LC-MS/MS[8]，氟環唑單劑主要分析方法有HPLC[9]、GC（ECD或NPD）和LC-MS/MS[10-11]，但是兩者復配制劑30%咪鮮胺·氟環唑微乳劑的分析方法尚未見報道。筆者采用反相高效液相色譜法，使用外標法同時測定30%咪鮮胺·氟環唑微乳劑中2種有效成分的質量分數，供相關人員參考。

1 試劑及儀器

1.1 試劑

甲醇（色譜級），默克（德國）股份兩合公司；乙腈（色譜級），飛世爾科技公司；水（新蒸二次蒸餾水）；咪鮮胺標樣（已知含量不小于98%）和氟環唑標樣（已知含量不小于98%），沈陽化工研究院；30%咪鮮·氟環唑微乳劑（20%咪鮮胺＋10%氟環唑），河北中保綠農作物科技有限公司。

1.2 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀和2489 UV-Vis檢測器，沃特世科技（上海）有限公司；UV-6100紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；0.45 μm孔徑的有機過濾器，天津科億隆實驗設備有限公司；濾膜，上海密粒膜分離技術有限公司。

1.3 色譜操作條件

色譜柱為Inert Sustain C18Column不銹鋼柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm）；流動相為V甲醇∶V乙腈∶V水=30∶40∶30，經濾膜過濾，并進行脫氣；柱溫為室溫，流速為1.0 mL/min，檢測波長為225 nm，進樣量為5 μL。

2 實驗方法

2.1 溶液的配制

分別稱取咪鮮胺標準品0.05 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）和氟環唑標準品0.025 g（純度為98.7%，精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40 mL甲醇，利用超聲波處理5 min，待標準品完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得咪鮮胺質量濃度約為1 mg/mL、氟環唑質量濃度約為0.5 mg/mL的標樣溶液，進行過濾后存于4℃冰箱待測。

稱取含咪鮮胺0.05 g和氟環唑0.025 g的試樣（精確至0.000 2 g）于50 mL棕色容量瓶中，加入40mL甲醇，利用超聲波處理15 min，待試樣完全溶解后定容并上下顛倒搖勻，制得質量濃度約為5 mg/mL的試樣溶液，進行過濾后存于4℃冰箱待測。

2.2 測定

用1.3中檢測試樣有效成分的檢測條件長時間地平衡C18色譜柱和檢測儀器，觀察檢測器響應值的波動情況直到其持續呈現一條直線并無噪音干擾時（基線波動范圍應小于10-3），用標樣溶液測試有效成分峰面積的相對偏差（應小于1.5%），待色譜柱及儀器達到最佳檢測狀態，檢測誤差符合檢測標準時，取2.1中配制好的標樣溶液和試樣溶液進行測定。

2.3 計算

試樣中有效成分咪鮮胺或氟環唑的質量分數w（%）按式（1）進行計算：

式中：A1為標樣溶液中咪鮮胺（或氟環唑）峰面積的平均值，mAU；A2為試樣溶液中有效成分咪鮮胺（或氟環唑）檢測峰面積的平均值，mAU；m1為咪鮮胺（或氟環唑）標準品的質量，g；m2為試樣的質量，g；P為咪鮮胺（或氟環唑）標準品的質量分數，%。

3 結果分析與討論

3.1 檢測波長的判定

分別對咪鮮胺和氟環唑標樣溶液進行全波長掃描，獲得了兩者的紫外吸收光譜（圖1）。在205 nm和203 nm處，咪鮮胺和氟環唑的吸光度較高，但在實際檢測中，采用較低檢測波長時，靈敏度不佳。因此，本方法最終選定225 nm作為檢測波長，此處兩者均有較強吸收，且雜質影響較小。

圖1 氟環唑和咪鮮胺紫外全波長掃描圖

3.2 流動相的選擇

在30%咪鮮·氟環唑微乳劑有效成分質量分數檢測中，通過不斷地調整流動相中甲醇、乙腈和水的配制比例，觀察峰型變化和出峰快慢，依次對多種不同比例的流動相進行篩選。最終檢測結果表明，當甲醇、乙腈、水的體積比為30∶40∶30時，分離效果最佳，色譜峰峰形尖銳，出峰時間短，滿足分析要求（圖2、圖3）。此外由于試樣由溶劑、助劑和有效成分配制而成，在試樣溶液的液相色譜圖（圖3）中，2.911min左右出現助劑峰，但與有效成分的峰之間分離效果良好，不影響檢測結果的精密度和準確度。

圖2 標樣液相色譜圖

圖3 30%咪鮮·氟環唑微乳劑的液相色譜圖

3.3 分析方法的線性關系

稱取一定質量的咪鮮胺和氟環唑標準品，用純甲醇配制成質量濃度為2.0 mg/mL的咪鮮胺母液和質量濃度為1.0 mg/mL的氟環唑母液于4℃冰箱保存。依次吸取咪鮮胺母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5mL進行稀釋，制得0.20～2.0 mg/mL的一系列不同質量濃度的標樣溶液；依次吸取氟環唑母液1.0、1.25、2.5、5.0、7.5 mL進行稀釋，制得0.10～1.0 mg/mL的一系列不同質量濃度的標樣溶液。之后用1.3的實驗操作條件對各質量濃度的標樣溶液進行測定并記錄各針的檢測峰面積。繪制標準曲線，得到咪鮮胺和氟環唑的線性方程。結果表明咪鮮胺和氟環唑均具有良好的線性關系，咪鮮胺的回歸方程為y=13 009.06 x＋193 422.30，相關系數R2為0.999 9；氟環唑的回歸方程為y=9 818.05 x＋43 258.51，相關系數R2為0.999 4（圖4、圖5）。

圖4 咪鮮胺線性關系圖

圖5 氟環唑線性關系圖

3.4 分析方法的精密度

在上述色譜檢測條件下，對30%咪鮮·氟環唑微乳劑試樣重復進行5次獨立測試，有效成分相對標準偏差應小于2（1-0.5logC）×0.67，其中C為樣品中有效成分含量，以小數計[12]。由檢測結果可見，試樣中咪鮮胺質量分數的相對標準偏差為0.57%（＜1.711），氟環唑質量分數的相對標準偏差為0.60%（＜1.890），均符合分析要求（n=5）。因此該分析方法的精密度良好（表1）。

表1 方法精密度測定結果（n=5）

3.5 分析方法的準確度

稱取5份含咪鮮胺0.05 g和氟環唑0.025 g的已知質量分數的試樣，再分別加入咪鮮胺標準品（約0.05 g）和氟環唑標準品（約0.025 g），對其有效成分含量進行測定，計算回收率，檢測結果見表2。咪鮮胺（100.09%）和氟環唑（99.94%）的平均回收率均較高，符合分析標準。

表2 分析方法的回收率測定結果（n=5）

4 結 論

本文針對30%咪鮮胺·氟環唑微乳劑建立了可以同時檢測有效成分咪鮮胺和氟環唑的高效液相色譜分析方法，并對此方法進行了方法驗證，結果表明咪鮮胺和氟環唑均具有良好的線性關系，分離效果較好，檢測結果重現性良好，精密度較高，回收率均達到了99%以上，方法準確度較高，且簡單高效易操作，因此該方法可用于產品質量檢測，具有很強的可行性和實際應用價值。