甘草黃酮亞組分及甘草黃酮C對TNF-α致腸上皮屏障損傷的保護作用研究△

張娟，孫宇，徐曉琴，卿德剛

新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002

結腸是人體腸道的一部分，維持著消化系統的平衡。結腸上皮屏障功能障礙會引起消化不良、便秘、排便混亂等一系列癥狀[1]，因此，緩解結腸屏障功能損傷有利于消化道疾病的治療。研究證明，黃酮類成分可以通過抑制炎癥或者直接調節屏障功能，發揮改善腸道屏障功能的作用[2-4]。流行病學研究也表明，攝入黃酮類成分可以預防腸道炎癥，從而降低炎癥性腸病、結腸癌、2 型糖尿病、非酒精性肝炎等多種疾病的風險[3,5]。甘草黃酮臨床上用于治療胃及十二指腸球部潰瘍，同時對炎癥性腸病和結腸癌也有預防作用[6-8]，但是，現有研究并未完全闡明甘草黃酮中的活性成分，臨床用藥中無法實現對其質量的有效控制。本實驗制備大鼠小腸隱窩上皮細胞IEC-6 炎癥模型，從甘草黃酮中篩選出抗炎活性亞組分，進一步考察活性亞組分及其主要成分對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導的人結腸癌上皮細胞Caco-2 腸上皮屏障損傷模型的細胞因子分泌和屏障功能改變的影響，探討兩者對腸道屏障的保護作用和可能通路，為后續深入研究提供參考。

1 材料

1.1 細胞

IEC-6細胞來源于中國科學院典型培養物保藏委員會昆明細胞庫；Caco-2 細胞來源于中國科學院上海細胞資源中心。

1.2 試藥

甘草黃酮購自新農甘草產業有限責任公司（批號：2015H001，純度＞45%）；胎牛血清（FBS，ExcellBio公司）；DMEM培養基、青霉素-鏈霉素雙抗（PS，10 000 U）和胰蛋白酶（0.25%Trypsin-EDTA）均購自Gibco 公司；重組人胰島素（Solarbio 公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS）粉劑（北京中杉金橋生物技術有限公司）；CCK-8細胞增殖/毒性檢測試劑盒（北京全式金生物技術有限公司）；Transwell小室（Corning公司）；白細胞介素-6（IL-6）、IL-8酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（杭州聯科生物技術股份有限公司）；TNF-α（PeproTech 公司）；閉合小環蛋白-1（ZO-1）、咬合蛋白（Occludin）、肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK）、肌動蛋白（β-actin）抗體（Abcam 公司）；二甲基亞砜（DMSO）和柳氮磺胺吡啶（SASP）均購自Sigma 公司；異硫氰酸熒光素-右旋糖酐-40（FD-40）和甘草黃酮C（licoflavone C，LicoC）均購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 儀器

SmartCellHF-90 型二氧化碳培養箱、HF1200LC型生物安全柜（上海力康儀器有限公司）；DK-80型臺式低速離心機（上海飛鴿儀器有限公司）；EclipseTS100-F 型熒光倒置顯微鏡（日本Nikon 公司）；xMark 型酶標儀、Mini-PROTEAN Tetra system型轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；FLUO star OPTIMA型熒光酶標儀（德國BMG 公司）；Millicell-ERS 型電阻測定儀（美國Millipore 公司）；DYCZ-24DN 型電泳儀（北京六一儀器廠）。

2 方法

2.1 甘草黃酮亞組分制備

取甘草黃酮140 g以水混懸，乙酸乙酯等體積萃取3 次，揮干溶劑得到浸膏112 g。浸膏以硅膠柱色譜進一步分離，石油醚-丙酮梯度洗脫（100∶0、100∶5、10∶1、9∶1、8∶1、6∶1、4∶1）制備亞組分，最終收集了74 個亞組分，以薄層色譜法檢識，選擇組成有差異且相對單一的20 個亞組分（GCH1～GCH20）繼續后續實驗，見圖1、表1。

表1 甘草黃酮亞組分信息

圖1 甘草黃酮亞組分制備流程

2.2 細胞培養與單層細胞模型制備

IEC-6 細胞以培養基（DMEM+10%FBS+1%PS+100 μg·mL-1insulin），37 ℃，5%CO2培養。待融合率達90%時，胰酶消化，制備成5×104個/mL 的單細胞懸液。Caco-2 細胞以培養基（DMEM+10% FBS+1% PS），37 ℃，5%CO2培養。待融合率達80%時，胰酶消化。取指數期Caco-2細胞以5×104個/mL 接種于Transwell小室常規培養，2 d 更換1 次培養基，以電阻儀測定單層細胞跨上皮電阻（TEER）監測單層細胞形成情況，待TEER 穩定后，體外腸上皮單層細胞模型制備成功。

2.3 甘草黃酮亞組分對IEC-6細胞存活率的影響

取IEC-6單細胞懸液接種至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培養24 h 至細胞貼壁。分設空白組、對照組、甘草黃酮各亞組分組（100 μL，20μg·mL-1溶液），根據分組以各亞組分干預，培養48 h后，棄培養基，每孔加入10%CCK-8 溶液100 μL，繼續孵育1 h，酶標儀檢測450 nm 處吸光度（A），根據公式（1）計算細胞存活率。

2.4 甘草黃酮亞組分對TNF-α 誘導的IEC-6 細胞IL-6 分泌的影響

IEC-6 細胞參照2.3 項下方法接種。設對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、陽性對照組（SASP，2 mmol·L-1）和甘草黃酮各亞組分組（20 μg·mL-1），根據分組加入陽性藥和亞組分提前干預2 h，之后加入TNF-α培養48 h，收集細胞上清液，按照ELISA試劑盒說明書方法檢測各組IL-6水平。

2.5 GCH15化學成分分析

采用高效液相色譜分析篩選獲得的抗炎活性組分GCH15的化學成分并測定其含量[9-10]。

2.6 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導的Caco-2 細胞IL-6和IL-8分泌的影響

取Caco-2單細胞懸液接種至96孔板（100 μL/孔），37 ℃、5% CO2培養24 h 至細胞貼壁。分設對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、陽性藥對照組（SASP，2 mmol·L-1）組、GCH15低、中、高劑量（GCH15-L、GCH15-M、GCH15-H，5、10、20 μg·mL-1）組和LicoC低、中、高劑量（LicoC-L、LicoC-M、LicoC-H，5、10、20 μmol·mL-1）組。根據分組加入陽性藥和亞組分提前干預2 h，之后加入TNF-α培養48 h，收集細胞上清液，按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測各組IL-6和IL-8水平。

2.7 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導的Caco-2 單層細胞通透性的影響

參照2.2 項下方法，將Caco-2 細胞接種于Transwell小室，待TEER值穩定后，按2.6項下方法分組處理細胞。37 ℃培養48 h，分別檢測處理前后TEER值。在Transwell小室頂端腔內加入HBSS溶液100 μL（含FD-40 1 mg·mL-1），37 ℃培養2 h，收集腔內溶液，熒光酶標儀測定熒光強度（激發波長480 nm，發射波長530 nm），實驗組與對照組的FD-40 熒光值之比計為FD-40相對通過水平。

2.8 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導的Caco-2 細胞Occludin、ZO-1及MLCK蛋白表達的影響

設對照組、TNF-α模型組（100 ng·mL-1）、GCH15 組（20 μg·mL-1提前干預2 h）和LicoC 組（20 μmol·mL-1提前干預2 h），培養48 h，提取細胞總蛋白，BCA法定量蛋白。經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后，將蛋白轉印至PVDF 膜，3% 脫脂奶粉封閉1 h，加入ZO-1、Occludin、MLCK 和β-actin 一抗，4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜，再加入二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜，ECL顯影，考察目標蛋白的相對表達量。

2.9 統計分析

3 結果

3.1 甘草黃酮亞組分對IEC-6細胞存活率的影響

甘草黃酮有一定毒性，因此，基于預試驗篩選結果，比較了20 個亞組分在質量濃度為20μg·mL-1時對正常IEC-6 細胞存活的影響。結果表明，除了GCH1、GCH5、GCH9、GCH13、GCH15 和GCH16，多數亞組分在該質量濃度下都會抑制IEC-6 細胞存活，見圖2。

圖2 甘草黃酮各亞組分對細胞存活率的影響（,n=3）

3.2 甘草黃酮亞組分對TNF-α 誘導的IEC-6 細胞IL-6 分泌的影響

結果表明，以TNF-α刺激IEC-6 細胞，能夠明顯促進細胞分泌IL-6（P＜0.05）。結果顯示，各亞組分在質量濃度為20 μg·mL-1時均可抑制IL-6 分泌，并以GCH2、GCH4、GCH8、GCH15和GCH19的抑制效果最為顯著（P＜0.05），見圖3。綜合各亞組分對正常IEC-6 細胞存活率的影響結果，選擇GCH15進一步研究。

圖3 甘草黃酮各亞組分對TNF-α誘導的IEC-6細胞IL-6分泌的影響（,n=3）

3.3 GCH15化學成分分析

為了明確GCH15中的活性成分，采用HPLC分析GCH15，并通過對照品比對，確認LicoC是GCH15的主要成分之一，質量分數為21.3%，見圖4。

圖4 GCH15和LicoC的HPLC圖及LicoC結構式

3.4 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導的Caco-2 細胞IL-6和IL-8分泌的影響

ELISA 結果顯示，以TNF-α刺激Caco-2 細胞，能夠明顯誘導炎性細胞因子IL-6 和IL-8 的分泌（P＜0.01）。以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干預則能顯著降低Caco-2 細胞中IL-6 和IL-8 水平，并呈一定的劑量相關性，說明LicoC是GCH15中的抗炎活性成分，見圖5。

圖5 GCH15和LicoC對TNF-α誘導的Caco-2細胞炎性因子分泌的影響（,n=3）

3.5 GCH15 和LicoC 對TNF-α 誘導的Caco-2 單層細胞通透性的影響

與對照組比較，TNF-α刺激Caco-2 單層細胞可引起TEER值降低（P＜0.01）和FD-40相對通過水平升高（P＜0.01），表明單層細胞通透性增加，屏障功能紊亂。與模型組比較，以GCH15 5、10、20 μg·mL-1和LicoC 5、10、20 μmol·mL-1提前干預能提高TEER值，降低FD-40相對通過水平，并呈一定的劑量相關性，說明兩者有利于保護腸道屏障完整性，對TNF-α誘導的屏障功能損傷具有保護作用，見圖6～7。

圖6 GCH15和LicoC對TNF-α誘導的Caco-2單層細胞TEER的影響（,n=3）

圖7 GCH15和LicoC對TNF-α誘導的Caco-2細胞FD-40通過水平的影響（,n=3）

3.6 GCH15和LicoC對ZO-1和Occludin表達的影響

TEER值下降和FD-40相對通過水平升高，提示緊密連接結構受到破壞，故以免疫印跡法（Western blot）檢 測GCH15 和LicoC 對ZO-1 和Occludin 表 達的影響。結果表明，TNF-α的刺激可使Caco-2 細胞ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平降低（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干預則能逆轉TNF-α引起的ZO-1 和Occludin 蛋白表達水平降低（P＜0.05，P＜0.01），說明兩者可以通過保護緊密連接結構維持腸道屏障功能，見圖8。

圖8 GCH15和LicoC對TNF-α誘導的Caco-2細胞ZO-1和Occludin蛋白表達的影響（,n=3）

3.7 GCH15和LicoC對MLCK表達的影響

TNF-α刺激Caco-2 單層細胞，可以明顯促進MLCK 蛋白表達（P＜0.01）。以GCH15 20 μg·mL-1和LicoC 20 μmol·mL-1提前干預，則能逆轉TNF-α引起的MLCK 蛋白表達上調（P＜0.01），說明兩者可能通過調節MLCK，防止腸道屏障緊密連接功能紊亂，見圖9。

圖9 GCH15和LicoC對TNF-α誘導的Caco-2細胞MLCK蛋白表達的影響（,n=3）

4 結論

腸上皮細胞和封閉細胞旁間隙的連接復合體是腸道屏障的結構基礎，其中緊密連接對調節細胞旁轉運和維持屏障完整性至關重要[11]。緊密連接由50多個前蛋白組成，包括ZO-1、ZO-2 和ZO-3 等細胞質外周膜蛋白，以及Occludins 和Claudins 等跨膜蛋白[12]。ZO-1 在緊密連接功能中起著直接和間接的中心作用，不僅能夠連接跨膜蛋白（Occludins 和Claudins）和其他緊密連接蛋白、肌動蛋白骨架，而且可以調節細胞旁通道[13]。炎性刺激和其他內源性細胞因子通過減少緊密連接蛋白的定位與表達直接影響腸上皮屏障，腸上皮屏障通透性增加又會促使內毒素和促炎因子更易移位于組織內部，導致慢性炎癥持續存在。因此，維持細胞間結構完整、改善腸上皮屏障功能，有助于改善消化道疾病引起的炎癥反應。

TNF-α是引起腸道屏障損傷的重要啟動因子，不僅可以通過MLCK 通路重塑細胞骨架，引起緊密連接前的肌動球蛋白環收縮和緊張性增加，促使ZO-1 和Occludin 等緊密連接蛋白和周圍細胞骨架蛋白重新分布、緊密連接結構移位、細胞旁通路開放、腸道通透性增加，而且還會誘導IL-6 和IL-8 等細胞因子分泌，推動炎癥級聯反應，進一步加劇緊密連接結構的損傷[14-16]。本實驗首先利用TNF-α誘導的IEC-6炎癥細胞模型，從甘草黃酮中篩選出抗炎活性亞組分GCH15，并通過HPLC 對照品指認法確認其主要成分是LicoC。進而，以TNF-α誘導的Caco-2腸道屏障損傷細胞模型，考察GCH15 和LicoC 對炎癥反應的抑制作用和對屏障功能的保護作用。結果顯示，以TNF-α刺激可以促進Caco-2 細胞分泌IL-6和IL-8，降低單層細胞TEER值，提高FD-40相對通過水平，GCH15 和LicoC 則能明顯逆轉TNF-α引起的炎癥反應及細胞屏障功能紊亂，兩者均以劑量依賴的方式抑制IL-6 和IL-8 分泌，增加單層細胞TEER 值，降低細胞間通透性，即能夠通過抗炎和維持屏障完整性發揮對腸道屏障功能的保護作用。TNF-α可以促進Caco-2 細胞MLCK 表達，而MLCK過表達可以誘導肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，從而調節肌動蛋白收縮、細胞骨架重塑[17]，引起ZO-1和Occludin 等緊密連接蛋白表達與分布的變化，弱化緊密連接屏障功能，升高屏障通透性[18]。有研究證實，以MLCK 抑制劑抑制MLCK 信號通路的激活，可以改善結腸炎小鼠的腸黏膜屏障功能[19]。因此，進一步以Western blot檢測了GCH15 和LicoC 對緊密連接蛋白和MLCK表達的影響。結果，以TNF-α刺激Caco-2 細胞，ZO-1 和Occludin 表達明顯下降，MLCK 表達明顯升高，提示MLCK 通過調節緊密連接蛋白參與了屏障功能的改變，以高劑量的GCH15和LicoC 提前干預Caco-2 細胞，則可以逆轉TNF-α誘導的ZO-1 和Occludin 表達下降、MLCK 表達升高，說明兩者可能是通過MLCK 調節緊密連接，從而維持腸道屏障完整性的。

甘草黃酮雖已應用于臨床，但是受研究深度的限制，其中的活性成分并未被完全闡明，目前僅以總黃酮含量作為質量控制指標。本實驗通過體外實驗篩選出甘草黃酮中的活性成分LicoC，進行單體層次上的活性評價，為闡明甘草黃酮活性成分、有效控制產品質量提供了基礎數據，并且，一定程度上拓展了對甘草保護胃腸道的認識。但是，本實驗只是體外考察，后續還需要進行體內驗證，并應深入、細化篩選，以明確甘草黃酮中的活性物質組，為闡釋甘草黃酮組效關系提供更充分的依據。