定量核磁共振波譜法測定白芷中歐前胡素含量

楊 蘭， 李 欠， 馮彥梅， 邱黛玉

(甘肅農業大學農學院中草藥栽培與鑒定系，甘肅省中藥材規范化生產技術創新重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

中藥白芷為傘形科植物白芷[Angelicadahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.]或杭白芷[A.dahuricae(Fisch.exHoffm.)Benth.etHook.f.var.formosana(Boiss.)ShanetYuan]的干燥根[1]，始載于《神農本草經》，并列為中品，因干燥初生根為芷，色白，故名白芷，在中國有著悠久的藥食兩用的歷史[2]。白芷性溫，氣芳香，味辛，微苦，具有解表散寒、通竅止痛、祛風除濕、消腫排膿、抗炎、解熱、美白等作用，在臨床實踐中，廣泛應用于風寒感冒、頭痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、赤白帶下、癰疽瘡瘍、濕盛久瀉等病癥，特別是用于風寒侵犯陽陰引起的頭痛，其療效較顯著[3-8]。除作藥用外，在食品、保健品、香料、護膚美容、日用化工等方面也有廣泛的應用[9]，特別是其干燥根作為調味料可增香添味，脫臭除異，增進食欲[10]。

白芷中主要的生物活性成分有香豆素、揮發油、多糖和微量元素[11]。香豆素主要包括歐前胡素、異歐前胡素、佛手柑內酯、氧化前胡素、水合氧化前胡素和異珊瑚菜素[12]。在2015版藥典中常用歐前胡素含量對白芷進行質量評價[13]。目前，歐前胡素的測定多采用高效液相色譜法，該法存在耗時(出峰時間為11.6 min)、樣品預處理復雜、標準品價格昂貴等缺點。因此，建立一種快速、可靠的測定白芷中歐前胡素含量的方法具有一定的現實意義[14-18]。近年來，1H核磁共振波譜法(1H qNMR)已被廣泛成功地應用于化學藥品、中藥及植物提取物、液體樣品、異構體、食品等的定量分析[19-20]。該法具有檢測時間短、樣品預處理簡單、儀器操作相對簡單、特異性好以及分析過程中不需要昂貴的對照品等優點。其基本原理是特征峰的峰面積與質子數成正比，常用絕對內標定量法，即以待測物與已知內標物的峰面積的比值確定待測物的含量[21-26]。

本研究采用氫核磁共振建立白芷中歐前胡素含量測定新方法，并對白芷樣品進行分析，并用高效液相色譜法(HPLC)驗證測定結果。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

核磁共振儀(400 MHz，MestReNova數據處理軟件，Bruker公司產品)；超聲清洗器，深圳市得康科技有限公司產品；HH-S數顯恒溫水浴鍋，江蘇正基儀器有限公司產品；電子天平，慈溪市天東衡器廠產品；循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司產品；JFSD-100粉碎機，上海嘉定糧油儀器有限公司產品；高效液相色譜儀，島津公司產品。

歐前胡素，上海源業生物科技有限公司產品，≥98%；對苯二酚，上海麥克林生化有限公司產品，≥99%；氘代二甲基亞砜(DMSO-d6)，劍橋同位素實驗室有限公司產品，≥99.9%；甲醇，天津市富宇精細化工有限公司產品，≥99.5%。

白芷購于四川省遂寧市的新橋、大英、新勝等地。

1.2 測試條件

采用zg30脈沖序列，測定溫度為293.7 K，譜寬(SWH)為8 012.8 Hz，采樣時間(AQ)為4.0 s，弛豫時間(D1)為1 s，脈沖寬度(P1)14.90 s，樣品掃描次數(NS)32次，空掃次數(DS)為2次。色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：甲醇(A)-水(B)；流速：1.0 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：250 nm；進樣量：20 μl。

1.3 溶液制備

內標溶液的制備：準確稱取30 mg內標物對苯二酚溶解至6.0 ml DMSO中，制得內標溶液，作為核磁共振波譜法(qNMR)定量的內標樣品。供試品溶液制備：采用劉紅梅等[27]的方法進行制備。取白芷粉末(過40目篩)約25 g，精密稱量，置于容量瓶中，精密加入甲醇125 ml，超聲波處理(40 min，40 ℃)，靜置冷卻，取上清液，重復2次。將2次提取液合并，過濾，濾液水浴加熱得粗浸膏，稱量粗浸膏質量。取粗浸膏0.06 g，精密稱量，加0.5 ml內標溶液，超聲波溶解，移置核磁管，用于氫核磁共振法測定。取上述粗浸膏0.06 g，精密稱量，加入3 ml甲醇，超聲波溶解，過微孔濾膜(0.45 μm)，移置進樣小瓶，用于高效液相色譜法測定。核磁共振標準品溶液的制備：準確稱取3 mg歐前胡素標準品，溶解至0.5 ml內標溶液中，制得標準品溶液，備用。

2 結果與分析

2.1 溶劑、內標與定量峰的選擇

測定結果表明，歐前胡素及對苯二酚在DMSO-d6中均有較好的溶解性，且譜峰不重疊，因而選用DMSO-d6作為溶劑，對苯二酚作為內標。以歐前胡素中δ7.65峰為定量峰，對苯二酚中δ6.55峰為內標定量峰(圖1)。

2.2 定量核磁共振波譜法的方法學驗證

2.2.1 線性關系 分別精密稱取標準品3 g、4 g、5 g、6 g、7 g、8 g，并各加入0.5 ml內標溶液，制備6個不同濃度的樣品溶液，測定1H NMR波譜。分別對標準品和內標物特征信號峰的峰面積進行積分，每個樣品的積分面積取3次積分的平均值。以標準品和內標物的積分面積比值(Y)對標準品和內標物質量比值(x)進行線性回歸，得出回歸方程(圖2)。圖2表明標準品與內標物質量比值在1.2至3.2范圍內與兩者定量峰面積比值呈良好的線性關系。

圖1 歐前胡素(A)、對苯二酚(B)和兩者的混合物(C)的1H qNMR波譜Fig.1 1H quantitative nuclear magnetic resonance(qNMR) spectra of imperatorin (A), hydroquinone (B) and their mixture (C)

圖2 標準品與內標物質量比、面積比的線性關系Fig.2 The linear relationship of mass ratio and area ratio between standard and internal standard

2.2.2 精密度 取制備的核磁共振波譜法標準品溶液，在核磁共振測試條件下，重復測定5次。以標準品定量峰面積與內標物定量峰面積的比值計算相對標準偏差(RSD)，RSD=0.654%。

2.2.3 穩定性 取用于氫核磁共振波譜法測定的溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、10 h、12 h、24 h進樣測定。以樣品定量峰與內標物定量峰面積比值計算RSD，RSD=1.339%，表明供試品溶液室溫放置24 h穩定。

2.2.4 重復性 在核磁共振波譜法測定溶液制備條件下，平行制備6份供試品溶液，在同一試驗條件下測定。以樣品定量峰面積與內標物定量峰面積的比值計算RSD，RSD=1.837%，表明重復性良好。

2.2.5 加樣回收率 取同一批已知含量的樣品浸膏約0.03 g，精密稱量，平行6份，分別精密加入0.5 ml歐前胡素對照品溶液，超聲波溶解，移至核磁管，在核磁共振測試條件下測定，計算回收率，結果見表1。

表1 1H核磁共振波譜法(1H qNMR)測定白芷中歐前胡素的回收率

2.3 樣品中歐前胡素含量測定及HPLC驗證

取制備樣品0.06 g，精密稱量，制備供試品溶液，進行核磁共振波譜法測定(表2、圖3)。計算樣品中歐前胡素含量(W1)，W1=A1W2M1n2/A2M2n1，式中W1、W2分別為目標物、內標物的質量，A1、A2分別為目標物、內標物的積分面積，M1、M2分別為目標物、內標物的分子量，n1、n2分別為目標物、內標物的質子數。由表2可知，產自新橋、大英和新勝的白芷中歐前胡素含量分別為0.204%、0.200%和0.220%。另外，采用高效液相色譜法對白芷樣品中歐前胡素含量進行測定，結果表明兩種方法所得結果無顯著差異(表2、圖4)。

表2 1H核磁共振波譜法(1H qNMR)和高效液相色譜法(HPLC)測定白芷中歐前胡素含量

圖3 新橋(A)、新勝(B)、大英(C)白芷提取物的1H核磁共振波譜圖Fig.3 1H qNMR spectra of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

圖4 新橋、新勝、大英白芷提取物的高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of Angelica dahuricae extracts from Xinqiao(A), Xinsheng(B) and Daying(C)

3 結 論

本試驗建立了定量核磁共振波譜法測定白芷中歐前胡素含量的方法。該法具有檢測時間短、樣品預處理簡單、儀器操作相對簡單、特異性好、分析過程中不需要昂貴的對照品等優點，且測定結果與高效液相色譜法基本一致。采用1H qNMR法測定了白芷中歐前胡素含量，并用HPLC法驗證。結果表明，1H qNMR法和HPLC法的定量測定結果基本一致。1H qNMR法可用于白芷中歐前胡素含量的測定，為白芷質量控制提供了一種快速、有效的新方法。