水相體系中Amadori 化合物的合成及檢測方法研究

李 碩， 張 建， 張連富*，，3

（1. 江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122；2. 石河子大學 食品學院，新疆 石河子832003；3. 北京工商大學 北京食品營養與人類健康高精尖創新中心，北京100048）

美拉德反應是含氨基的化合物與含有羰基的化合物之間發生的一系列復雜的化學反應，最終生成棕色或黑色的大分子物質類黑精[1]。 一般認為美拉德反應可以分為初級、中級、高級3個階段，而阿瑪多利化合物（Amadori Compounds，ACs）為其初級反應所形成的穩定產物[2]。 ACs 純品一般為白色或黃色的固體，易溶于水和甲醇，本身沒有氣味，但卻是重要的非揮發性香味前體物質[3]。 美拉德反應普遍存在于食品的加工、儲藏與烹飪過程中，對產品的風味、色澤、口感等有著重要影響[4]。 余佳浩等[5]研究表明，ACs 可以有效抑制血管緊張素轉化酶的活性，從而有效抑制心腦血管疾病產生。 此外，ACs 還可以有效清除化學體系中活性氧自由基[6]。 而美拉德反應中后期產物雖然對食品的風味、色澤等有重要作用，但同時也會產生一些有害物質，例如糖基化最終產物AGEs，過量的AGEs 積累會導致一些慢性病的發生[7-8]，因此調控美拉德反應的進程尤為重要。

作者前期已經成功在有機相中合成了8種ACs， 并利用液質聯用的方法建立了8種ACs 定性定量檢測的方法， 但由于食品中氨基酸種類較多，每種氨基酸在適當的條件下都有可能形成ACs，因此這個檢測方法并不能真實地反應食品中ACs 的含量，而且有機相中的優化條件并不適用于食品體系，不能指導工業化生產。 所以探究如何在水相中合成更多種的ACs，并建立多種ACs 定性定量檢測的方法尤為重要。

作者在水相體系中合成4種ACs 的方法，建立12種ACs 的UPLC-MS/MS 同步檢測的方法， 并對該方法進行方法學驗證，使其能更加真實地代表食品體系中美拉德反應產生ACs 的總量，檢測了市售產品中ACs 的含量，驗證了該方法的適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、甘氨酸、D-葡萄糖、 氫氧化鈉、 濃鹽酸、 氨水、 甲酸、 甲酸銨、2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司產品；C18固相萃取小柱： 美國Sepax 科技有限公司產品；Dowex 50WX4 氫型（200～400 目）離子交換樹脂：百靈威科技有限公司產品；色譜級甲醇和乙腈：美國Tedia 公司產品；超純水，實驗室自制。

表1 不同產地與品種的果蔬干樣品Table 1 Dried fruits and vegetables samples from different origins and varieties

1.2 儀器與設備

1525 高效液相色譜儀（蒸發光檢測器）、MALDI SYNAPT MS 超高效液相串聯四極桿飛行時間質譜聯用儀、UPLC-TQD 超高效液相色譜串聯四級桿質譜 聯 用 儀： 美 國 Waters 公 司 產 品；Aduance Ⅲ400 MHz 全數字化核磁共振波譜儀： 德國布魯克AXS 有限公司產品；RV06-ML型旋轉蒸發儀：德國IKA 公司產品； 超純水儀： 美國密理博公司產品；HJ-6 多頭磁力攪拌器： 金壇市醫療儀器廠產品；電子天平：上海梅特勒-托利多儀器商貿公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 ACs 的合成作者前期合成的8種ACs 參照 以 下 方 法 進 行[9]。 Fru-Val（Fru-Leu、Fru-His、Fru-Ala、Fru-Met、Fru-Phe）化合物按照以下方法進行合成。 300 mmol/L 的D-葡萄糖溶解在400 mL 的甲醇-N，N-二甲基甲酰胺溶液中（體積比1∶1），加入400 mmol/L 的氨基酸， 然后制備好的溶液在80 ℃下回流3 h。加入90 mmol/L 丙二酸，在80 ℃下繼續回流2 h 直至淺棕色， 用旋轉蒸發儀將有機相濃縮至50 mL 左右。

Fru-Arg 化合物按照以下方法進行合成。 L-精氨酸溶于由30 mL 吡啶和30 mL 冰醋酸組成的混合溶劑中，室溫下攪拌1.0～1.5 h，將氯化鋅加入混合物中，隨后D-葡萄糖緩慢加入溶液中，在30 ℃下攪拌5 d。

Fru-Glu 化合物按照以下方法進行合成。 準確稱取氫氧化鉀完全溶解在240 mL 無水甲醇中，將研磨后的谷氨酸鈉添加到溶解有氫氧化鉀的無水甲醇中，將液體轉移到盛有D-葡萄糖的250 mL 燒瓶中，75 ℃回流35 min，用冰水冷卻至室溫，將有機相旋蒸濃縮至50 mL， 然后在-20 ℃冷凍3～4 h，過濾取上清液加入預冷的-18 ℃丙酮沉淀， 真空抽濾并用丙酮兩次洗滌濾餅。 將所得的固體溶于30 mL無水甲醇中，加入1 mL 乙酸，在75 ℃條件下回流20 min。

將上述反應混合物冰水浴冷卻至室溫，過濾取上清液加入預冷的-18 ℃丙酮沉淀，在10000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，收集沉淀物，用無水甲醇復溶，再用丙酮沉淀，反復重結晶幾次，用一定量的超純水溶解晶體并冷凍干燥，得到白色固體。

Fru-Pro（Fru-Ser、Fru-Thr、Fru-Gly）化合物按照以下方法進行合成。 分別稱取L-脯氨酸5.7565 g（0.05 mol）與D-葡萄糖和9.008 g（0.05 mol）溶于50 mL 去離子水中，置于磁力攪拌器中攪拌，使其完全溶解。 將溶液pH 調至7.4。 然后將溶液轉移至120 mL 耐壓瓶中， 于100 ℃油浴鍋中反應60 min。反應結束后，立即放入冰水中冷卻。 在50 ℃旋轉蒸發器中蒸發掉反應溶液中的水。 其余3種氨基酸根據溶解度差異， 分別配置成不同質量濃度的溶液，L-絲氨酸反應溶液、L-蘇氨酸反應溶液、 甘氨酸反應溶液分別配置成0.2853、0.1496、0.2552 mg/mL。

1.3.2 ACs 的純化加入少量水溶解旋蒸后固體，用適量活性炭除去反應溶液中的色素等雜質后，將其轉移至填充有Dowex 50WX4 樹脂的柱中， 用去離子水沖洗掉葡萄糖等雜質，直至TTC 測試顯示陰性為止。 然后用0.2 mol/L 的氨水溶液洗脫樹脂，收集TTC 測試呈陽性的洗脫液，每10 mL 洗脫液收集在一個離心管中。隨后用HPLC-ELSD 檢測，收集只含有ACs 的洗脫液。 所有洗脫液合并后進行冷凍干燥得到ACs 固體粉末。

其中，HPLC-ELSD 所使用的色譜柱為XBridge BEH Amide（5 μm，4.6 mm×250 mm）。 柱溫：35 ℃，氣體流量：1.5 L/min；流量：1 mL/min，進樣量：20 μL。該方法流動相分別為乙腈（A 相）和10 mmol/L 甲酸銨水溶液（B 相），采用梯度洗脫的方法進行測定，流動相A 梯度變化如下：0 min 到5 min，A 相由體積分數80% 變為70% A；5 min 到10 min，A 相由體積分數70%變為65%；10 min 到11 min，A 相由體積分數65%變為80%；11 min 到15 min，A 相由體積分數65%變為80%，總時間為15 min。

1.3.3 ACs 的UPLC-MS/MS 分析采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用儀 （UPLCMS/MS）進行分析鑒定。

其中色譜條件如下，色譜柱：CORTECS C18（1.6 μm，2.1 mm×150 mm）；柱溫：35 ℃，流量：0.3 mL/min；進樣量：1 μL；流動相A 相為乙腈，B 相為體積分數0.1%甲酸。 采用梯度洗脫的方法，流動相A 梯度變化如下：0 min 到2 min，A 相為體積分數0%，2 min到5 min，A 相由體積分數0%變為10%，5 min 到7 min，A 相由體積分數10%變為40%，7 min 到8 min，A 相由體積分數40%變為80%，8 min 到8.10 min，A 相由體積分數80%變為0%，8.10 min 以后，A 相維持體積分數0%，總共運行10 min。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子電離模式（ESI+），離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；毛細管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔電壓：20 V；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞能量：6.0 eV；m/z：100～1000；檢測電壓：1600 V；高純氮氣（99.999%）。 使用Mass Lynx 軟件對數據進行處理。

1.3.4 ACs 的NMR 分析稱取10 mg 產物溶于氘水中。 25 ℃（298K）條件下，在配備有5 mm PABBO探針的Bruker DRX 400 MHz 波譜儀上進行操作，得 到1H -NMR 譜 和13C -NMR 譜 后， 利 用MestReNova 軟件處理數據。

1.3.5 單標準儲備溶液的配置分別準確稱量適量Fru-Arg，Fru-Phe，Fru-His，Fru-Met，Fru-Glu，Fru-Leu，Fru-Val，Fru-Ala，Fru-Pro，Fru-Ser，Fru-Thr，Fru-Gly 12種ACs 的標準品于燒杯中，加入少量超純水溶解， 待完全溶解后， 分別定容至10 mL容量瓶，所有儲備液于4 ℃冰箱中保存。

1.3.6 建立UPLC-MS/MS 定性定量測定ACs 的方法利用超高效液相色譜串聯四級桿質譜聯用儀對ACs 進行定性定量分析。

液相條件：色譜柱：CORTECS C18（1.6 μm，2.1 mm×150 mm）；流動相：A 相：乙腈，B 相：體積分數0.1%甲酸；柱溫：35 ℃，流量：0.3 mL/min；進樣量：1 μL，梯度洗脫程序：0 min B 相體積分數100%，1 min 到5 min，B 相由體積分數100%變為90%，5 min 到6 min，B 相由體積分數90%變為50%，6 min 到7 min，B 相由體積分數50%變為20%，7 min 到9 min，B 相保持體積分數20%，9.0 min 到9.5 min，B 相由體積分數20%變為100%，9.5 min 到13.0 min，B 相保持體積分數100%， 總運行時間為13 min。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子電離模式（ESI+），離子源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：400 ℃；毛細管電壓：2.5 kV；脫溶劑氣流量：600 L/h；錐孔氣流量：50 L/h；m/z：100～1000；檢測電壓：1600 V；高純氮氣（99.999%）。

1.3.7 方法學驗證方法學驗證主要從線性范圍、檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、回收率、精密度等方面出發。 取各ACs 標準品儲備液用超純水稀釋成一系列濃度梯度。 按上述液質方法測定。 測定結果以標品質量濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行繪制標準曲線，并做線性回歸分析。 LOD 和LOQ 方面主要稀釋ACs 標品，用液質檢測其相應信號，以目標峰的信噪比為10 時所對應的ACs 質量濃度為LOQ，以目標峰的信噪比為3 時所對應的ACs 質量濃度為LOD。 選取已知的ACs 含量的模擬體系溶液，分別添加/不添加ACs 標品，比較加標組和不加標組ACs 的差異，并計算相應的回收率。 精密度試驗主要是同一個模擬體系樣品溶液在24 h 內間隔測定5次，比較所測樣品質量濃度的相對標準偏差（RSD）。

1.3.8 市售果蔬干產品中ACs 的檢測首先采用GB 5009.3-2016 對市售13種果蔬干產品進行水分含量的測定，計算產品的水分質量分數。

分別稱取13種果蔬干產品各5 g， 加入50 mL超純水打漿，倒入離心管中，超聲波提取20 min，10000 r/min 條件下冷凍離心10 min， 取上清液定容至100 mL，待凈化使用。選取固相萃取小柱，先用3 mL 甲醇活化小柱， 再用3 mL 超純水平衡小柱，取2 mL 上清液至C18 小柱中， 用3 mL 超純水洗脫，收集洗脫液并定容至10 mL，隨即用1.3.6 方法UPLC-MS/MS 測定產品中的ACs 含量。

1.3.9 數據統計分析所有數據使用SPSS 19.0 軟件處理，以平均值±標準偏差的形式表示。 所有實驗重復3次，p＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 ACs 的合成與純化

在水相中合成4種ACs，無污染，并且適用于大規模生產。 美拉德反應產物的純化分離主要采用Dowex 50WX4 氫型離子交換樹脂，葡萄糖不與樹脂結合，直接被去離子水沖洗掉，氨基酸和ACs 與樹脂結合后，被氨水先后洗脫下來；隨后用TTC 進行檢測，當洗脫液中含有ACs 時，使無色的氧化型的TTC 還原成紅色的還原型的TTC，使樣品染成紅色；由于ACs 對紫外沒有吸收，因此選用對絕大部分物質都有響應的蒸發光檢測器對洗脫液進行檢測，進一步分離氨基酸與ACs，選擇只含ACs 的洗脫液并將其合并凍干，得到白色或者淡黃色粉末，由于ACs極其容易吸潮，所以應隔絕空氣保存。

2.2 UPLC-MS/MS 分析ACs

制備后得到的ACs 純品配成約1 mg/mL 的標品溶液，使用UPLC-MS/MS 進行分析。 結果表明，4種ACs 的純度均高于98%。 以Fru-Pro 為例，根據其分子結構及質譜結果分析，其在液質中可能的碎裂規律如圖1 所示。該標品的總離子流色譜圖（圖2（a））中僅存在一個單峰，其保留時間為1.14 min，另外圖2（b）為Fru-Pro 的質譜圖。 標品在質譜中的碎裂規律基本與苑蘅等人[10]的研究一致。 從質譜圖中可以看出，4種ACs 的質荷比（m/z）分別為Fru-Pro：278；Fru-Ser：268；Fru-Thr：282；Fru-Gly：238。 其中4種化合物的碎片離子[M+H-H2O]+、[M+H-2H2O]+、[M+H-3H2O]+也分別在各自的質譜圖中觀察到，以[M+H-H2O]+碎片離子信號最強，這與Cui 等人[11]的研究一致。 從Fru-Pro 質譜圖中可以看出，[M+HH2O]+和[M+H-2H2O]+碎片離子的信號峰最強，這也表明了ACs 在質譜中極容易脫掉水。 液質結果表明4種ACs 的分子式和相對分子質量分別為Fru-Pro（C11H19NO7，277），Fru-Ser （C9H17NO8，267），Fru-Thr（C10H19NO8，281），Fru-Gly（C8H15NO7，237）。

圖1 UPLC-MS/MS 譜中Fru-Pro 片段Fig. 1 Fru-Pro fragment in UPLC-MS/MS spectrum

2.3 NMR 分析ACs

Fru-Pro 的1H-NMR 和13C-NMR 見圖3。 由于ACs 在水中可進行互變異構， 糖骨架可形成α-呋喃結構、β-呋喃結構、α-吡喃結構和β-吡喃結構，共有5種同分異構體，根據環張力和取代基位阻的分析，4種異構體的穩定性順序為：β-吡喃環>α-呋喃環>β-呋喃環>α-吡喃環。5種同分異構體如圖4 所示。

圖2 Fru-Pro 的總離子流色譜圖和質譜圖Fig. 2 Total ion chromatogram and mass spectrometry of Fru-Pro

圖3 Fru-Pro 的1H-NMR 與13C-NMRFig. 3 1H-NMR and 13C-NMR of Fru-Pro

圖4 Fru-Pro 的5種同分異構體Fig. 4 Five isomers of Fru-Pro

13C-NMR 上可把峰分為11 組， 每組峰基本由不同強度的4個峰組成，強度比約為10∶3∶2∶1，按每組4個峰分別對應4種異構體，則相同碳位的信號峰比較相近。 糖環上的碳因五元環和六元環的環張力有較大差異，所以3-5 位的碳的信號峰位移差別明顯，根據以上分析，將每組峰根據化學位移歸屬至各個碳位，再根據各組內峰的強弱歸屬至不同的異構體，分析得出化學位移歸屬，結果見表2。

表2 Fru-Pro 的化學位移分析Table 2 Chemical shift analysis of Fru-Pro

2.4 UPLC-MS/MS 測定方法的建立

超高效液相色譜串聯質譜-質譜聯用技術（UPLC-MS/MS）以其高分辨率和高靈敏度被廣泛用于多種有機化合物的同步快速分析。 作者建立了一種UPLC-MS/MS 的方法用于同步分析12種ACs 化合物。 12種ACs 的色譜分離使用CORTECS C18柱，流動相分別為乙腈（A）和甲酸（B）。 比較了不同的流動相梯度對12種ACs 的分離效果和保留時間的影響，并確立了最終的液相條件。 質譜方面，根據12種ACs 在質譜中的碎裂規律確立了其相應的母離子和子離子，采用MRM 進行同步分析。根據先前的研究，正離子模式下的質譜掃描的結果要優于負離子模式，因為氨基和羧基等在正離子模式下更容易穩定。 作者也發現12種ACs 在正離子模式下有著更好地響應。 選擇信號最強的碎片離子作為子離子，根據12種化合物的質譜結果，確立了其最佳的母 離 子 和 子 離 子 為Fru-Arg：337→114，Fru-Glu：310→148，Fru-His：318 →190，Fru-Met：312→294，Fru-Leu：294 →230，Fru-Val：280 →216，Fru-Ala：252 →234，Fru-Phe：328→292，Fru-Pro：278 →260；Fru-Ser：268 →250；Fru-Thr：282 →264；Fru-Gly：238 →220。 隨后，對12種ACs 的錐孔電壓和碰撞能量進行優化，結果如表3 所示。 在12種ACs 的質譜圖中，[M+H-H2O]+和氨基酸的氫離子加合物都是其特征子離子，這和文獻報道一致[12]。 另外，[M+H-2H2O]+的碎片離子也表現較強的信號。 隨后， 對該UPLC-MS/MS 方法進一步進行了方法學驗證。

表3 用于多反應監測的ACs 的MS 參數Table 3 MS parameters of ACs for multiple reaction monitoring

如表4 所示，4種化合物的標準曲線的相關性系數（R2）均大于0.99。 儀器檢測靈敏度主要通過其對標品的檢測限（LOQ）和定量限（LOQ）來評估，結果見表4。本方法有著較好的回收率，這可能是因為模擬體系中樣品基質比實際食品體系簡單，因此目標物更容易保留。 精密度實驗通過樣品的5次不同時間段測定值的相對標準偏差來評估。 這些數據均表明作者所建立的方法具有良好的重現性，并適合實際體系的ACs 的分析。

表4 ACs 的UPLC-MS / MS 方法的分析特征Table 4 Analytical characteristics of ACs by UPLC-MS / MS method

2.5 市售果蔬干產品中ACs 質量分數的檢測

表5 果蔬干產品中ACs 的質量分數Table 5 ACs content in commercially available dried fruits and vegetables mg/g

由表5 可以看出，13種果蔬干產品中含有大量的ACs 化合物，這可能是因為果蔬產品在加工過程中經過熱處理而產生的，其中，枸杞、馬奶子和桂圓中ACs 質量分數最多，分別達到了10.73，6.80，5.36 mg/g，而ACs 質量分數較低的有奇異果，圣女果，芒果干和西梅干等。 而每種果蔬干產品中所含ACs 的種類和含量各不相同，這可能是由于每種果蔬中本身所含有的氨基酸與還原糖種類不同，并且每種果蔬干產品的加工方式不同所導致。 桂圓中含量較高的氨基酸有谷氨酸和丙氨酸，馬奶子中含量最高的氨基酸為谷氨酸，葡萄干中氨基酸含量最高的為精氨酸，在產品中這些氨基酸相對應的ACs 產物也是最多的。從表5 可以看出，ACs 質量分數較高的果蔬干產品中，他們的水分質量分數也較低，這有可能說明低水分活度更容易使產生大量的ACs。

續表5mg/g

3 結 語

通過在水相中加熱葡萄糖與氨基酸的美拉德反應，制備了Fru-Pro，Fru-Ser，Fru-Thr，Fru-Gly。通過大孔樹脂、HPLC-ELSD、UPLC-MS/MS 和NMR 鑒定并表征了4種ACs，純度均在98%以上，其分子式及相對分子質量分別為Fru-Pro（C11H19NO7，MW：277），Fru-Ser（C9H17NO8，MW：267），Fru-Thr（C10H19NO8，MW：281），Fru-Gly（C8H15NO7，MW：237）。建立了液質同步檢測12種ACs 的方法， 該方法目標物分離度高，分離時間短，經方法學驗證，該方法線性關系好，靈敏度高，更能真實地反應食品體系中ACs 的含量。