阿拉善雙峰駝酸駝乳中乳酸菌的分離鑒定及耐酸和耐鹽研究

FAHAD Shah，徐鴻洋，智超，宮海萌，張和平，趙國芬，*

（1.內蒙古農業大學生命科學學院，內蒙古呼和浩特010011；2.江南大學化學與材料工程學院，江蘇無錫214122）

駝奶營養成分豐富[1-3]，有一定的保健功效，在糖尿病、肺結核、肝炎、貧血、食物過敏反應和消化道疾病等的治療中有改善作用[4-6]。而酸駝乳風味濃郁，口感醇厚，極具民族特色，除了具有駝奶的營養價值外，還有一定的抗菌和益生特點，是一個極具市場競爭力的新產品。其中微生物菌系十分復雜，含有豐富的對人體有益生作用的乳酸菌及酵母菌資源。而不同地域的酸駝乳中的乳酸菌種類和數量又存在特別大的差異[7-10]，因此其風味也有所差異。但目前有關酸駝乳的研究甚少，酸駝乳的工業化生產急需開發其中的微生物資源。

阿拉善盟雙峰駝是內蒙古自治區的特色動物，駝產業是阿拉善地區的支柱產業，駝奶資源豐富，本研究旨在充分利用好地區資源并結合產業優勢，以開發傳統發酵酸駝乳中的乳酸菌資源，生產自主研發的、風味獨特酸駝奶制品為宗旨，從傳統發酵酸駝乳中分離優勢乳酸菌并進行鑒定、耐酸性和耐鹽性研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

酸駝乳（ASR）、鮮駝乳（AXR）、馬奶：來自內蒙古阿拉善地區牧民家中經過傳統發酵、巴氏消毒。酸駝乳傳統發酵數天放置于密封塑料壺中冷凍保存運到實驗室，與鮮駝奶一起置于4℃冰箱中暫時保存。

1.1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、2×PCRmix、溶菌酶（20000U/mg）、蛋白酶K（≥40 U/mg protein）：大連寶生物工程有限公司；引物（7F/1540R）、dNTP Mix：天根生化科技有限公司。

無水乙醇、異丙醇、氯化鈉、D（+）-無水葡萄糖、檸檬酸銨、蛋白胨、瓊脂、牛肉浸粉、酵母提取粉、硫酸錳、磷酸氫二鉀、乙酸鈉、硫酸鎂、吐溫-80：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 主要設備

TG16-W微量高速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；THZ-100B恒溫培養搖床：上海一恒科學儀器有限公司；E1509020紫外可見分光光度計：上海菁華科技儀器有限公司；DYY-10C型核酸電泳儀：北京市六一儀器廠；Ver Sa Doc2000凝膠成像系統：美國Bio-Rad公司；LD2X-30KA立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；徠卡DMLB型顯微鏡：德國徠卡顯微鏡與系統公司；DELTA320 pH計：METTLER TOLEDO。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制

按微生物學試驗指導的方法配制[11]。

1.2.2 酸駝奶樣品的梯度稀釋、pH值測定與涂布培養

將從阿拉善牧人家獲取的1份傳統發酵的阿拉善雙峰駝酸駝奶樣品用pH計測定pH值，測定3次，取平均值。按照表1的感官評分標準進行評分然后將稀釋到10-5的酸駝奶樣品涂布在普通MRS固體培養基進行培養[12]。將長出的的單菌落刮取一定量，在MRS固體培養基上進行劃線純化4次，將分離純化得到的疑似乳酸菌進行感官評定和革蘭氏染色分析形態[13]。

表1 感官評定評分表Table 1 Sensory assessment scale

1.2.3 基于16 SrDNA疑似乳酸菌的分子生物學鑒定

利用細菌基因組提取試劑盒分別對分離純化的疑似乳酸菌菌液提取基因組，利用7F/1540R引物聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增16 SrDNA片段[14]，然后將PCR產物電泳后回收，送由基因公司測序。將測序結果用Blast與NCBI中的Gene Bank數據庫中近緣菌株的16 SrDNA進行同源性比對，使用MEGA7軟件進行系統進化樹的構建，確定疑似菌株的分類地位。

1.2.4 乳酸菌在MRS液體培養基中生長曲線的測定

將鑒定為乳酸菌的菌株分別接種到液體MRS培養基中37℃進行搖床培養，約4 h后按2%的體積比例接種到新的MRS液體培養基中進行培養，每隔2 h測定OD600nm。

1.2.5 乳酸菌耐酸性、產酸性和最佳pH值的確定

按2%的體積比例接種已鑒定的乳酸菌菌液到pH值分別調為4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養基中，37℃搖床培養，測定12 h的OD600nm，以在MRS培養基中培養為對照，分析各個菌株在不同pH值下的生長情況及存活率，來判斷其耐酸性。

按2%的體積比例接種已鑒定的乳酸菌菌液到中性的MRS液體培養基中培養，分別測定12、24、48 h的pH值，判斷各個菌株的產酸性能。

將已鑒定的乳酸菌接種在MRS液體培養基中進行活化，取活化好的菌株以3%體積比的接種量分別接種到 pH 值分別為 3.5、4.5、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的 8種MRS液體培養基中，37℃恒溫搖床中生長24 h，測定OD600nm，確定其最佳pH值。

1.2.6 乳酸菌耐鹽性分析

按3%的體積比例分別接種乳酸菌菌液到NaCl濃度分別為2%、4%、6%和8%的液體MRS培養基中，每隔2 h測定一次OD600nm，判斷各菌對不同濃度的NaCl的耐受性。

1.2.7 乳酸菌對鮮馬奶和鮮駝奶反發酵試驗

將已經鑒定的乳酸菌菌液經擴大培養后以3%的體積比例分別接種到分裝好的已滅菌的鮮馬奶和鮮駝奶中35.5℃進行發酵，分別測定發酵24、48、72 h的pH值，考察其發酵情況。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離鑒定

將3株乳酸菌提取基因組DNA后，用16 SrDNA引物擴增16 SrDNA片段，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1，都有與16 SrDNA目的片段大小一致的條帶出現，說明16 SrDNA基因片段擴增成功。

1號～3號乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構建的進化樹見圖2～圖4。

圖1 3株菌的16 SrDNA PCR產物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of 16 S rDNA PCR products of three strains of Lactobacillus

圖2 1號乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構建的進化樹Fig.2 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.1

圖3 2號乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構建的進化樹Fig.3 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.2

圖4 3號乳酸桿菌的16 SrDNA基因片段構建的進化樹Fig.4 Evolutionary tree by 16 SrDNA gene fragment of Lactobacillus No.3

傳統發酵阿拉善雙峰駝酸駝奶樣品的pH值為4.12～4.16，經過感官評定，該酸駝奶樣品的評分結果為：色澤26分，較均勻、乳黃色；口感14分，純正；酸味15分，較酸；甜味8分，較淡；乳味13分，乳味很重。從中分離純化出3株乳酸菌，菌落清晰、均一明顯。顏色呈乳黃色，菌落相對較小、圓形、凸起，發出較濃酸味。菌體革蘭氏染色為陽性，呈短桿狀。

分別提取3株菌的DNA，用7 F/1540 R引物進行16 S rDNA擴增、電泳（圖1）和回收后測序，將測序結果在Gene Bank中進行Blast，并使用MEGA7軟件構建進化樹，結果如圖2～圖4。結果表明，1號菌、2號菌和3號菌分別為Lactobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，與這3個菌株的16 SrDNA序列相似性分別為99.9%、99.9%和99.8%，均屬于植物乳酸桿菌屬。

2.2 乳酸菌在MRS液體培養基中的生長曲線

將已鑒定的3株乳酸菌分別在液體MRS液體培養基中37℃培養，每2 h測定一次OD600nm繪制的生長曲線如圖5。

圖5 3株乳酸菌的生長曲線Fig.5 Curve of growth curve of three strain of Lactobacillus

3株菌均在4 h左右開始進入對數生長期，11.5 h后基本達到穩定生長期穩定期，一直持續到22 h左右，后逐漸進入凋亡期。

2.3 乳酸菌耐酸性、產酸性和最佳pH值

為比較3個菌株的耐酸性，分別將3株乳酸菌在pH值分別為4.0、3.0、2.0和1.0的MRS液體培養基培養，以MRS培養基為對照，比較在不同pH值環境中的生存率，來反映其耐酸性強弱，結果如圖6所示。

圖6 不同pH值下3株乳酸菌的存活率Fig.6 Survival rate of three strains of Lactobacillus at different pH

由圖6可知，1號、2號株菌在pH值大于3時存活率都在50%以上，pH值為3時，3號菌存活率為48.2%，說明3株菌的耐酸性都很好，且在pH值為1時仍然能生長。pH值為2時，3株菌也可以生長，只不過生長速度下降了，說明3株菌均可以耐胃酸這樣的環境。若這些菌種用來發酵駝奶，利于其順利通過胃部進入腸道在消化道中生存而發揮其益生活性。

培養液中的pH值可反映微生物生長過程中的產酸性能。為了解3株菌的產酸性能，測定3株乳酸菌菌液分別在中性的MRS液體培養基中培養12、24、48 h的pH值，3株乳酸菌的產酸性能見圖7。

由圖7可知，3株菌均能產酸，培養基中pH值下降不大，且規律大致相同，產酸性能適中，不僅對成品酸駝乳的風味有重要影響，也可有效防止雜菌污染。

圖7 3株乳酸菌的產酸性能Fig.7 Acid production performance of three strains of Lactobacillus

為了解乳酸菌培養的最適pH值將3株乳酸菌在不同pH值的MRS中培養24 h，測定OD600nm，結果見圖8。

圖8 不同pH值下3株乳酸菌的生長情況Fig.8 Growth of three strains of Lactobacillus at different pH value

結果表明3株菌的最適pH值均為6.5。耐酸微生物是指最適pH值接近中性時能生長，而嗜酸微生物是指最適pH值小于3的微生物，所以，3株菌均屬于耐酸微生物，不屬于嗜酸微生物。

2.4 乳酸菌的耐鹽性

駝奶相對牛奶鹽度較高，對鹽度的耐受性反映乳酸菌可否在高鹽濃度下發酵駝奶并正常生存。3株乳酸菌對不同NaCl濃度耐受性情況如圖9所示。

圖9 3株乳酸菌對不同NaCl濃度的耐受力Fig.9 Tolerance of three strains of Lactobacillus to different NaCl concentrations

由圖9可知，含2%NaCl的MRS培養基中乳酸桿菌可以正常生長，其生長規律與在MRS培養基中基本相似；在含4%NaCl的MRS培養基中，乳酸桿菌的對數生長期被延遲，且未達到較高的菌體濃度，在達到相應較高生長濃度后受到抑制，劇烈下降后持續快速生長，說明4%鹽濃度的耐受有一個適應的過程；在含6%NaCl的MRS中，乳酸菌的延滯期和對數生長期都得到延遲，而且生長速度明顯變慢，出現了持續明顯的抑制現象；含8%NaCl的培養基中，乳酸菌生長受到嚴重抑制，并且在生長到6 h時急劇下降后又有明顯上升趨勢，但始終受到高濃度的NaCl的抑制，基本無法在此環境中正常生長。耐鹽微生物能夠生長在很廣的鹽濃度范圍內，但最適宜其生長的是在鹽濃度0.2 mol/L（即 2.9%）[15]。所以，3 株均為耐鹽微生物，這些耐鹽乳酸菌在駝奶發酵過程中使用，有助于改善酸駝奶風味和防治雜菌感染。

2.5 乳酸菌可發酵鮮馬奶和鮮駝奶

測定了3株乳酸菌在35.5℃發酵鮮馬奶和鮮駝奶24、48、72 h的pH值，結果如表1和表2所示。

表2 乳酸菌發酵駝奶不同時間點的pH值Table 2 The pH value of lactic acid bacteria fermented camel milk at different time points

表3 乳酸菌發酵馬奶不同時間點的pH值Table 3 The pH value of lactic acid bacteria fermented horse milk at different time points

經乳酸桿菌發酵而成的酸駝奶和酸馬奶在酸度上與天然發酵駝奶和馬奶非常接近，利用相同方法從中也可分離得到相應乳酸菌；經過感官評定也發現其口感與天然發酵酸駝奶和酸馬奶極其相似（天然酸駝奶的pH值為4.12～4.16，天然酸馬奶的pH值為3.80～4.20）。

3 結論

對來自阿拉善地區傳統發酵的阿拉善雙峰駝酸駝乳中的乳酸菌進行了分離鑒定及耐酸性和耐鹽性的研究結果表明，分離出3株乳酸菌，經鑒定均為乳桿菌屬，分別是 Lactobacillus plantarum strain KC28、Lactobacillus plantarum strain K25和Lactobacillus sp.D1501，是阿拉善地區傳統發酵的阿拉善雙峰駝酸駝乳中的優勢菌。3株菌均為革蘭氏陽性，菌落均清晰、較小、圓形、凸起，發出較濃酸味，顏色呈乳黃色；耐酸性很好；產酸性能一般；最適pH值均為6.5；在不超過2%的鹽度下生長不受影響，為耐鹽微生物。如果將分離菌株合理組合，會開發出生物學特性獨特、風味優良的駝奶發酵菌劑，并且有望在胃腸道環境中發揮重要生理作用。