HPLC法檢測幾種α-酮酸化合物的柱前衍生化條件優化

楊陽 焦淑玲 朱美旗

摘 ? ? ?要：目的 為了篩選柱前衍生-HPLC法測定-酮酸化合物的最優衍生化條件。方法 采用紫外分光光度法檢測-酮酸標準品衍生化后的最大吸收波長。運用單因素試驗，以柱前衍生-HPLC法所檢測出的峰面積作為評價指標，對影響衍生化反應的因素（pH值、溫度、加熱時間、物質的量的比例）進行優化。結果 丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽與衍生化試劑4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA）反應所得的衍生化產物產生的紫外吸收最大波長約為260 nm。丁酮酸最佳衍生條件是pH=3、60 ℃、加熱2 h、衍生化試劑與其物質的量比為10∶1;丙酮酸鈉最佳衍生條件是pH=3、80 ℃、加熱1 h、衍生化試劑與其物質的量比為10∶1;酮戊二酸單鉀鹽最佳衍生條件是pH=5、80 ℃、加熱1 h、衍生化試劑與其物質的量比為8∶1。同時對該方法的線性范圍和精密度進行了考察。結論 本研究說明NPDA作為衍生化試劑與-酮酸類化合物反應后，能夠提高 -酮酸類化合物的檢測靈敏度和準確性，為檢測生物樣品、藥品、化妝品等中的-酮酸類化合物提供參考。

關 ?鍵 ?詞：-酮酸;NPDA;柱前衍生-HPLC法

中圖分類號：O658 ? ? ? ?文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）08-1820-05

Abstract： Objective In order to screen the optimal derivatization conditions for determination of α-keto acid compounds by pre-column derivatization-HPLC method.Methods The maximum absorption wavelength was determined by UV-spectrophotometry. Using single factor test， the peak area detected by HPLC-precolumn derivatization method was used as the evaluation index to optimize the influence factors of derivatization reaction（pH value， temperature， heating time and the proportion of the amount of substance）.Results The derivatized product obtained from the reaction of butyric acid， sodium pyruvate， ketoglutarate monopotassium salt with the derivatization reagent 4-nitro-1，2-phenylenediamine （NPDA） produced the maximum UV absorption wavelength of approximately 260 nm. The optimal derivatization conditions for butyric acid were as follows： pH=3， the temperature 60 ℃， the heating time 2 h， the molar ratio of derivatization reagent to its substance 10∶1; the optimal derivatization conditions for sodium pyruvate were as follows： pH=3， the temperature 80 ℃， the heating time 1 h， the molar ratio of derivatization reagent to the substance 10∶1; the optimal derivatization conditions of ketoglutarate monopotassium salt were as follows： pH=5， the temperature 80 ℃， the heating time 1 h， and the molar ratio of derivatization reagent to its substance 8∶1. At the same time， the linear range and precision of the method were investigated.Conclusion This study shows that NPDA， as a derivatization reagent， can improve the detection sensitivity and accuracy of α-keto acid compounds after reacting with α-keto acid compounds， and the paper can provide some reference for the detection of α-keto acid compounds in biological samples and drugs， cosmetics.

Key words： α-Keto acid; NPDA; Precolumn derivation-HPLC method

α-酮酸（Alpha-keto acid）是一種具有雙官能團的生物活性物質，可作為有機合成和生物合成的中間體，在醫藥、化妝品、食品等領域有重要的應用價值[1]。例如α-酮酸與低蛋白飲食搭配改善慢性腎炎患者的癥狀[2]，可以減少內源性尿素、有毒離子和代謝產物生成，還可以改善患者的營養狀況[3]; ?α-酮酸加入食品中，可以改善口感，還能促進脂肪的消耗[4];在化妝品中，α-酮酸具有保濕、防皺、抗衰老、抗過敏等功能[4]。

組織中α-酮酸的物質的量濃度可用于診斷氨基酸代謝先天缺陷疾病，如楓糖漿尿癥（MSUD）、苯丙酮尿癥（PKU）、高蛋氨酸血癥、酪氨酸血癥[5]。丙酮酸的水平可作為口腔癌或其他惡性腫瘤的篩查指標[6]。此外，因α-酮酸結構的特殊性，它可作為一些藥物的合成中間體[7]，所合成藥物可用于治療慢性腎病、惡性腫瘤、高血壓等疾病。通過對體內不同組織的α-酮酸進行含量測定，能夠檢測和研究藥物在體內的治療作用。

目前，測定α-酮酸類化合物的分析方法主要有高效液相色譜法（HPLC） [8-11]、氣相色譜法（GC）[12]和毛細管電泳法（CE）[13]。紫外檢測器（UVD）是測定生物樣品中α-酮酸常用的檢測器，在使用這種檢測器時，一般情況下會對α-酮酸進行衍生化，以便得到分離度高、響應值強的分析圖譜。本研究以4-硝 ? 基-鄰苯二胺（NPDA）為衍生化試劑對丁酮酸、丙酮酸以及酮戊二酸進行衍生化，其原理是鄰苯二胺類化合物與α-酮酸形成喹喔啉化合物進而產生紫外吸收。通過篩選最優柱前衍生化條件，為后續測定生物樣品、藥品，化妝品等中的α-酮酸提供參考。

1 ?實驗部分

1.1 ?儀器

ISO9001型微量電子天平，北京塞多利斯科學儀器有限公司;水浴鍋，鄭州長城科工貿有限公司;DG-800旋渦混合儀，鼎國昌盛生物技術有限責任公司;8453型紫外可見分光光度計，美國安捷倫公司;1260型高效液相色譜儀，美國安捷倫公司;KQ5200B超聲波清洗器，昆山市超市儀器有限公司。

1.2 ?試劑

丁酮酸，西格瑪奧德里奇（香港）控股有限公司;丙酮酸鈉，上海生工生物工程股份有限公司;酮戊二酸單鉀鹽，上海生工生物工程股份有限公司;甲醇，色譜純，西格瑪奧德里奇（香港）控股有限公司;4-硝基-1，2-苯二胺（NPDA），阿拉丁上海晶純試劑有限公司;濃鹽酸，分析純，上海生物工程技術有限公司;氫氧化鈉，分析純，上海生物工程技術有限公司。

1.3 ?溶液配制方法

1.3.1 ?10 mmol·L-1 NPDA溶液

稱取0.006 2 g NPDA溶于4 mL甲醇中，旋渦 ? 1 min使其充分溶解，4 ℃保存。

1.3.2 ?100 mmol·L-1 丁酮酸溶液

取17 μL丁酮酸純溶液溶于883 μL超純水中，充分混勻，4℃保存備用。

1.3.3 ?10 mmol·L-1 丙酮酸鈉溶液

稱取0.004 4 g丙酮酸鈉溶于4 mL超純水中，旋渦1 min使其充分溶解，4 ℃保存備用。

1.3.4 ?10 mmol·L-1酮戊二酸單鉀鹽溶液

稱取0.007 4 g丙酮酸鈉溶于4 mL超純水中，充分混勻，4 ℃保存備用。

1.3.5 ?0.5 mol·L-1鹽酸

取1 mL 2 mol·L-1鹽酸加入4 mL水中，充分混合，4 ℃保存備用。

1.3.6 ?0.5 mol·L-1氫氧化鈉

取1 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉加入4 mL水中，充分混合，4 ℃保存備用。

2 ?方法與結果

2.1 ?檢測波長的確定

丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽并沒有紫外吸收，因此需檢測衍生化反應前后紫外吸收波長的變化。首先，單獨取500 μmol·L-1 NPDA 200 ?L裝入石英比色皿中，在200～800 nm波長范圍掃描，測得有2個最大的吸收波長，分別是λ1=267.0 nm，λ2=404.0 nm。然后將10 mmol·L-1的NPDA稀釋至500 μmol·L-1，分別與丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽按照物質的量比1∶1在pH=3、溫度45 ℃、加熱時間20 min的條件下反應，分別取衍生化產物200 ?L置于石英比色皿中，在200～800 nm的范圍內掃描，結果如表1所示。測得的結果都接近260.0 nm，且在260.0 nm處的峰易于辨別，因此將260.0 nm作為檢測波長。

2.2 ?HPLC分離檢測條件

液相柱 250 mm×4.6 mm，5 μmol·L-1;柱溫35 ℃;流動相為甲醇和水（體積比為65∶35）;流速為0.7 mL·min-1;進樣量為10 μL;檢測波長為260 nm。

2.3 ?3種酮酸類化合物保留時間的確定

將1.3中配置的丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽母液稀釋至1、500、200 μmol·L-1。

1）取1 mmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽各100 μL，分別與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL混合，再加水100 μL，3種化合物的終濃度均為250 μmol·L-1，調節pH為3，在45 ℃下均反應20 min。

2）取500 μmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽各100 μL，分別與1 mmol·L-1 NPDA200 μL混合，再加水100 μL，3種化合物的終濃度均為125 μmol·L-1，調節pH為3，在45 ℃下均反應20 min。

3）取250 μmol·L-1的丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽各100 μL，分別與1 mmol·L-1 NPDA200 μL混合，再加水100 μL，3種化合物的終濃度均為50 μmol·L-1，調節pH為3，在45 ℃下均反應20 min。

上述配置了3種不同濃度的丁酮酸、丙酮酸鈉、和酮戊二酸單鉀鹽溶液，將它們的反應產物過0.22 μm濾膜后通過HPLC法檢測，方法如2.2中所述，進樣量為10 μL，結果如圖1所示。從圖1可以看出，丁酮酸的峰保留時間在8.7左右，丙酮酸鈉保留時間在5.7左右，酮戊二酸單鉀鹽保留時間在2.9左右。

2.4 ?衍生化反應條件的優化

2.4.1 ?pH值對衍生化反應進程的影響

取500 μmol·L-1丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽100 μL，各加100 μL的水，分別與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比2∶1）混合，設置4組平行試驗，分別調節pH值至3.0、5.0、7.0、9.0，每個pH下的溶液各配置3份，每份測定2次，45 ℃下反應20 min，反應產物過0.22 μm濾膜后，按2.2的條件測定，結果如圖2所示。從圖2可以看出，丁酮酸和丙酮酸鈉在pH=3時的峰面積最大，為反應最適pH條件，之后峰面積隨著pH的增大而逐漸減小;酮戊二酸鉀鹽在pH=5時的峰面積最大，衍生化反應受pH值影響較大。

2.4.2 ?溫度對衍生化反應進程的影響

取500 μmol·L-1丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽100 μL，各加100 μL的水，分別與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比2∶1）混合，根據2.4.1優選出來的最優pH分別調節pH，設置4組平行試驗，分別在25、40、60、80 ℃條件下反應20 min，每個溫度下的溶液各配置3份，每份樣品測定2次，反應液冷卻至室溫，反應產物過0.22 μm濾膜后，按2.2方法測定峰面積，結果如圖3所示。從圖3可以看出，丙酮酸鈉和酮戊二酸單鉀鹽的峰面積隨著溫度的升高而增加，在80 ℃時面積最大，因此最適反應溫度為80 ℃;丁酮酸在60 ℃和80 ℃反應產物的峰面積差別不大，但是在80 ℃時反應產物分解得到的副產物的峰面積大于產物的峰面積，因此選擇60 ℃為最優溫度。

2.4.3 ?加熱時間對衍生化反應進程的影響

取500 μmol·L-1丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽100 μL，各加100 μL的水，分別與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比4∶1）混合，取1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，加100 μL的水，與1 mmol·L-1 NPDA 200 μL（物質的量比2∶1）混合，根據2.4.1優選出來的最優pH分別調節pH，設置5組平行試驗，在2.4.2優選出來的最優溫度下分別反應10、20、30、60、120 min，每個時間下的溶液各配置3份，每份樣品測定2次，反應產物過0.22 μm濾膜后，按2.2方法測定峰面積，結果如圖4所示。

從圖4可以看出，丙酮酸鈉加熱60和120 min的峰面積變化不大，選擇60 min為最優反應時間;丁酮酸和酮戊二酸單鉀鹽反應120 min產物峰面積最大，選擇120 min為最佳反應溫度。

2.4.4 ?物質的量比對衍生化反應進程的影響

按照物質的量比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、 ? ?10∶1的比例取不同濃度的NPDA 200 μL 和500 ?mol·L-1的丙酮酸鈉和酮戊二酸單鉀鹽100 μL，分別混勻，按照物質的量比1∶1、2∶1、4∶1、8∶1、10∶1的比例取不同濃度的NPDA 200 μL和1 mmol·L-1的丁酮酸100 μL，混勻。不同比例的樣品在2.4.1優選出來的最優pH、2.4.2優選出來的最優溫度和2.4.3優選出來的最優加熱時間條件下反應，每個比例下的溶液各配制3份，每份樣品檢測2次，反應產物過0.22 μm濾膜后，按2.2方法測定峰面積，結果如圖5所示。從圖5可以看出，丁酮酸和丙酮酸鈉的峰面積隨著NPDA的量增加而增加，在 ? ?10∶1條件下反應最好;酮戊二酸單鉀鹽在8∶1條件下反應最好，NPDA的濃度繼續增大反而導致峰面積減小。

2.5 ?優化后標準曲線的制備

配制不同濃度的NPDA與丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽溶液，在優選出來的衍生化條件下反應，按2.2方法進行測定。各化合物的標準曲線如下：丁酮酸y=1.634 7x+22.423，R2=0.994 0，在42～666 μmol·L-1 范圍內線性關系良好;丙酮酸鈉y=2.589 1x-11.682，R2=0.996 4，在5～500 μmol·L-1范圍內線性關系良好;酮戊二酸單鉀鹽y=5.202 7x+45.423，R2 =0.997 1，在5～1 000 μmol·L-1 范圍內線性關系良好。

2.6 ?精密度檢測

在上述衍生化條件優選出的反應條件下配制樣品，每組均平行配制3份，每份樣品連續進樣2次，反應產物過0.22 μm濾膜后，按2.2方法進行測定，計算每組的平均相對標準偏差（RSD），以此來考察方法的重現性和儀器的穩定性。丁酮酸、丙酮酸鈉、酮戊二酸單鉀鹽衍生物峰面積的RSD值分別為0.14%、0.10%、0.07%，結果表明該方法的重現性和儀器的穩定性良好。

3 ?結 論

鄰苯二胺類化合物能夠與α-酮酸反應形成喹喔啉衍生物，使α-酮酸產生較強的紫外吸收。本試驗采用NPDA作為衍生化試劑進行研究，NPDA作為一種有效的柱前衍生試劑，在紫外區具有較高的靈敏度，用簡單的甲醇-水混合物等流動相進行洗脫分離容易。采用單因素試驗考察pH值、反應溫度、反應時間、物質的量比例對α-酮酸衍生化反應的影響。結果表明，丁酮酸最佳衍生條件是pH=3、溫度60 ℃、加熱2 h、衍生化試劑與其物質的量比為10∶1;丙酮酸鈉最佳衍生條件是pH=3、溫度80 ℃、加熱1 h、衍生化試劑與其物質的量比為10∶1;酮戊二酸單鉀鹽最佳衍生條件是pH=5、溫度80 ℃、加熱1 h、衍生化試劑與其物質的量比為8∶1。線性結果表明，3種化合物的線性均良好，精密度試驗表明該方法的選擇性和重現性均良好。

綜上所述，NPDA作為衍生化試劑與α-酮酸類化合物反應，能夠提高α-酮酸類化合物的檢測靈敏度和準確性，實驗結果可為檢測生物樣品、藥品、化妝品等中α-酮酸類化合物提供參考。

參考文獻：

[1]堵國成，宋陽，劉龍，等.α-酮酸的合成方法及應用研究[J].食品與生物技術學報，2013，32（11）：1121-1127.

[2]SATIRAPOJ B， VONGWATTANA P， SUPASYNDH O， et al. Very low protein diet plus ketoacid analogs of essential amino acids supplement to retard chronic kidney disease progression.[J]. Kidney research and clinical practice， 2018， 37（4）： 384-392.

[3]MALLET， ROBERT T. Pyruvate enhancement of cardiac performance： Cellular mechanisms and clinical appli-cation[J]. Experimental Biology and Medicine： Journal of the Society for Experimental Biology and Medicine， 2018，243（2）：198-210.

[4]向紀明.α-酮酸的應用及合成研究進展[J].安康學院學報，2011（5）：7-11.

[5]ROMAN K， PAVLA?， JANA J，et al. Determination of branched chain amino acids， methionine， phenylalanine， tyrosine and α-keto acids in plasma and dried blood samples using HPLC with fluorescence detection[J]. Clinical Chemistry & Laboratory Medicine， 2009， 47（5）：565-572.

[6]BHAT A，BHAT M，PRASAD K，et al. Estimation of pyruvic acid in serum and saliva among healthy and potentially malignant disorder subjects——a stepping stone for cancer screening [J]. Journal of clinical and experimental dentistry，2015，7（4）：462-465.

[7]杜燁，趙慧暉，吳毅，等.苯乙烯-丁二烯生膠有機酸含量測定不確定度評定[J].當代化工，2015，44（9）：2270-2273.

[8]毛影，畢中周.HPLC法測定酮戊二酸的含量[J]. 中國藥師，2008（10）：895-896.

[9]黎爽，劉蕊，馬博凱.反相高效液相色譜法測定水果中有機酸含量[J].現代科學儀器，2013（3）：145-146.

[10]馬麗娜，龔霄，殷俊偉，等.基于RP-HPLC法測定水果及其果酒中有機酸含量[J].食品工業，2018，39（1）：328-330.

[11]郭靜. 啤酒中三種酮類老化味物質的富集及分析方法的研究[D].沈陽：東北大學，2012.

[12]NGUYEN T， LEE G， PAIK M.Keto acid profiling analysis as ethoxime/tert-butyldimethylsilyl derivatives by gas chromatography- mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography B， 2013， 913-914： 48-54.

[13]蔣秀燕，王叢叢. ?CE法分離檢測對羥基苯丙酮酸互變異構體[J]. 合成材料老化與應用，2017，46（4）：60-63.