一種功能型酵母菌的構建及功能驗證

劉輝 何太波 趙國淼

摘 ? ? ?要：采用Golden Gate Assembly的方法，將糖化酶基因glaA導入到實驗室前期篩選的一株耐高溫釀酒酵母S.C HR的基因組中，篩選到了一株同時具有耐高溫及產糖化酶特性的功能型酵母COTYT-H。發酵實驗結果表明：所構建的COTYT-H菌株能夠分泌糖化酶，且能夠在高溫條件下具有良好的發酵性能，應用該菌株可在減少冷卻水用量、糖化酶用量、降低能耗、節約生產成本的同時，提高原料利用率，提升生產效益。

關 ?鍵 ?詞：糖化酶;酵母;乙醇

中圖分類號：TQ 926.4 ? ? ? 文獻標識碼： A ? ? ? 文章編號： 1671-0460（2020）08-1703-04

Abstract： The Golden Gate Assembly method was used to introduce the glucoamylase gene glaA into the genome of a thermotolerant yeasts SC HR which was screened earlier in the laboratory. A functional yeast COTYT with both high temperature resistance and saccharifying enzyme properties was selected. The fermentation experiment results showed that the COTYT-H strain constructed in this research could secrete saccharifying enzymes and had good fermentation performance under high temperature conditions. The application of this strain could reduce the amount of cooling water， the amount of saccharifying enzymes， reduce energy consumption and costs， as well as increase the utilization rate of raw materials and improve production efficiency.

Key words： Glucoamylase1; Yeast; Alcohol

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是長期并廣泛應用于發酵工業、乙醇生產及食品等行業的重要微生物[1]。酵母不能直接利用淀粉生產乙醇，因此通常采用糖化酶來分解淀粉[2-3]以供酵母利用。糖化酶亦稱葡萄糖淀粉酶、α-1，4-葡萄糖水解酶，從淀粉非還原性末端依次水解α-1，4-葡萄糖苷鍵，并使水解下來的葡萄糖構象發生改變，形成β-D-葡萄糖[4-6]。把糖化酶基因引入到釀酒酵母中，構建能分泌糖化酶的釀酒酵母，是目前酒精工業的研究方向之一[7-9]。目前酒精生產中廣泛應用的糖化酶主要產自黑曲霉（Aspergillus niger）、臭曲霉（Aspergillus foetides）、得氏根霉（Rhizopus niveus）和泡盛曲霉（Aspergillus awamori）等[10]。

在工業生產過程中，釀酒酵母需要面對高溫、滲透壓和乙醇等多種環境因素的脅迫[11-12]。傳統的釀酒酵母乙醇發酵的最適溫度在28～33 ℃，最高耐受溫度為35 ℃[13]。但在我國南方及盛夏時的北方地區，由于環境溫度較高以及發酵設備換熱能力不足，導致發酵罐內部核心溫度可達到40 ℃以上，嚴重抑制了酵母菌的生長和代謝，嚴重降低了生物乙醇的生產效率[14]。應用既能產糖化酶又能在高溫環境下具有良好發酵性能的釀酒酵母菌株，在發酵溫度較高時，可在保證酵母代謝正常進行的同時減少冷卻水用量，降低生產負荷，減少生產能耗。另外，其產糖化酶的特性，可自身分泌一部分的糖化酶，減少糖化酶的使用量，節約生產成本[15]。

本研究采用Golden Gate重組的方法[16-18]構建糖化酶基因glaA在釀酒酵母中的表達載體，將表達載體導入到實驗室前期篩選的一株耐高溫釀酒酵母S.C HR中進行整合，篩選出3株具有糖化功能的耐高溫釀酒酵母。進一步的發酵實驗結果表明，COTYT-H菌株具有耐高溫及產糖化酶的性能，能減少糖化酶的使用量，節約輔料成本。同時，其耐高溫的特性在維持生產穩定的同時降低冷凍水用量，降低能耗，節約生產成本，適合于乙醇的大規模生產。

1 ?實驗部分

1.1 ?材料

1.1.1 ?菌株和質粒

出發菌株S.C HR為前期實驗室誘變篩選到的耐高溫釀酒酵母;用于活性檢測酶表達用的畢赤酵母P. pastoris GS115和用于質粒構建、基因克隆的克隆宿主大腸桿菌（E. coli）DH5α均來自本實驗室;P. pastoris的表達質粒pGAPZa為組成型表達質粒，由實驗室前期自行構建保存;糖化酶表達盒的構建采用Golden Gate Assembly的方式進行組裝，中間構建質粒均為實驗室自行構建保存。

1.1.2 ?培養基

YPD固體培養基（質量分數）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖，15%瓊脂。

YPS固體培養基（質量分數）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%可溶性淀粉，15%瓊脂。

2YT固體培養基（質量分數）：1%酵母提取物，1.6%蛋白胨，0.5%NaCl，15%瓊脂。

1.2 ?分析方法

1.2.1 ?糖化酶基因篩選

通過對brenda-enzymes、PDB、NCBI數據庫進行搜索比對，獲得來源多個微生物的glaA基因，通過序列比對分析，選中來源扣囊復膜酵母Saccharomycopsis fibuligera的糖化酶glaA（Accession 19032257），氨基酸序列如下：

MIRLTVFLTAVFAAVASCVPVELDKRNTGHFQAYSGYTVARSNFTQWIHEQPAVSWYYLLQNIDYPEGQFKSAKPGVVVASPSTSEPDYFYQWTRDTAITFLSLIAEVEDHSFSNTTLAKVVEYYISNTYTLQRVSNPSGNFDSPNHDGLGEPKFNVDDTAYTASWGRPQNDGPALRAYAISRYLNAVAKHNNGKLLLAGQNGIPYSSASDIYWKIIKPDLQHVSTHWSTSGFDLWEENQGTHFFTALVQLKALSYGIPLSKTYNDPGFTSWLEKQKDALNSYINSSGFVNSGKKHIVESPQLSSRGGLDSATYIAALITHDIGDDDTYTPFNVDNSYVLNSLYYLLVDNKNRYKINGNYKAGAAVGRYPEDVYNGVGTSEGNPWQLATAYAGQTFYTLAYNSLKNKKNLVIEKLNYDLYNSFIADLSKIDSSYASKDSLTLTYGSDNYKNVIKSLLQFGDSFLKVLLDHIDDNGQLTEEINRYTGFQAGAVSLTWSSGSLLSANRARNKLIELL。

送往上海生工生物工程有限公司進行全基因合成并進行參照釀酒酵母偏愛的密碼子進行優化，根據密碼子優化后的基因序列信息設計擴增引物GA-F1和GA-SP-R1，并以全基因合成的glaA質粒為模板擴基因。其中擴增引物為：

GA-F1：AACACTGGACATTTCCAAGC;GA-SP-R1：TCAAAGAAGTTCAATCAATTTGTT。

選用釀酒酵母強啟動子和a-factor信號肽，采用OE PCR擴增獲得帶有信號肽的糖化酶片段，隨后采用golden gate assembly的方法構建完成糖化酶表達盒（圖1）。經測序驗證表達盒無誤后，采用OE PCR 連接抗性基因表達盒，選取釀酒酵母基因組多拷貝的rDNA為糖化酶基因的整合位點，采用Q5高保證酶一步擴增獲得組裝完成的基因組整合大片段。

1.2.2 ?耐高溫糖化酵母的構建

利用質粒提取試劑盒提取大腸桿菌中測序驗證正確的陽性克隆質粒。按照Bln I酶切體系將5～10 μg質粒在37 ℃水浴鍋中酶切線性化過夜;酶切產物的純化按照DNA純化回收試劑盒進行操作，回收后的線性化片段與80 μL GS115感受態細胞混合，電擊后立刻加入1 mL 1 mol·L-1預冷山梨醇，然后在30 ℃培養箱靜置孵育1～2 h。5 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，用 100 μL 1 mol·L-1的山梨醇重懸，重懸的細胞涂布于含有zeocin抗生素的YPD平板，30 ℃倒置培養3 d，觀察菌落生長情況;以平板上挑取的單菌落作為模板，所述菌落PCR條件進行陽性克隆鑒定，PCR反應結束后瓊脂糖凝膠電泳檢測，篩選得到陽性菌株。挑取生長出來的單克隆轉板至YPS平板進行糖化酶活性粗篩，整合糖化酶的基因工程菌在YPS平板上可見明顯的淀粉水解圈。進而挑取具有水解圈的轉化子，進行搖瓶培養3 d后，對其培養集中的糖化酶采用DNS方法進行酶活檢測。

1.2.3 ?重組釀酒酵母減糖化酶發酵性能驗證

以液化醪為底物，將目前工業生產使用商業釀酒酵母菌株（商業酵母）及構建獲得的菌株分別接種YPD搖瓶（500 mL），經過培養達到一定的酵母數，按0.125億·mL-1液化醪折算用量，離心、水洗一次，用生理鹽水懸浮至2.5 mL，洗凈后分別接種至加量0.9 kg·t-1糧（添加比例100%）和0.45 kg·t-1糧（添加比例50%）外源糖化酶的350 g液化醪中，發酵72 h，其中商業酵母一實驗組（100%糖化酶加量）發酵溫度32 ℃至發酵結束，期間溫度不調整，剩余實驗組進行調整發酵，調整方案：0～16 h溫度32 ℃，17 h溫度調至33 ℃，18 h溫度調至34 ℃，19 h溫度調至35 ℃至發酵結束。

2 ?結果與分析

2.1 ?糖化酶基因克隆及檢測

用高保真Pfu DNA聚合酶擴增得到glaA的cDNA序列約1 500 bp，與目的基因大小相符（圖2）。PCR產物經純化試劑盒純化回收后，與克隆載體pMD18相連轉入大腸桿菌E.coli DH5α感受態細胞，提取陽性克隆后送測序。測序結果表明，與S.fibuligera糖化酶（Accession 19032257）序列相似性為100%，證明已克隆得到glaA基因。

2.2 ?重組表達載體的構建與轉化

glaA與GS115連接轉化后，在LB/zeocin抗性平板上挑取單菌落于LB液體培養基中培養，提取質粒后經雙酶切得到約1 500 bp的產物，證明酵母重組表達載體GS115-glaA構建成功。選用釀酒酵母強啟動子和a-factor信號肽（引導糖化酶分泌胞外表達）構建糖化酶表達盒，采用OE PCR擴增獲得帶有信號肽的糖化酶片段，隨后采用golden gate assembly的方法構建完成糖化酶表達盒，擴增結果如圖3。經測序驗證表達盒無誤后，進一步用Q5高保證酶擴增糖化酶表達盒，采用OE PCR連接抗性基因表達盒，選取釀酒酵母基因組多拷貝的rDNA為糖化酶基因的整合位點，采用Q5一步擴增獲得組裝完成的基因組整合大片段，電泳結果如圖4。

2.3 ?糖化酶基因克隆及檢測

對挑取出的具有水解圈的轉化子，進行搖瓶培養3天后，對其培養基中的糖化酶采用DNS方法進行酶活檢測。由表1結果可知，整合耐高溫釀酒酵母S.C HR基因組后獲得了不同酶活水平的糖化酶釀酒酵母COTYT-H、COTYT-M和COTYT-L，其中COTYT-H酶活較高，COTYT-M次之，COTYT-L酶活最低。

2.4 ?功能型酵母發酵效果評價

2.4.1 ?成熟醪殘糖對比

殘總糖是酒精發酵后醪液內殘留的糖分，是衡量酒精發酵程度的重要指標之一，控制殘糖可有效提高發酵水平，提升經濟效益。通過表2的數據可以看出，商業酵母在高溫發酵條件下，殘總糖含量明顯升高，而功能型酵母在高溫發酵條件下仍能保持較低的殘總糖含量，在糖化酶加量降低50%以后，COTYT-H菌種仍具有較好的發酵效果。

2.4.2 ?成熟醪酒精度對比

通過圖5的數據可以看出，商業酵母在高溫發酵條件下，成熟醪內酒分含量明顯降低，而使用功能型酵母，高溫發酵條件下仍能保持較好的發酵水平，在糖化酶加量降低50%以后，COTYT-H菌種成熟醪酒分仍高于商業酵母（糖化酶100%，不調整溫度）實驗組。

3 ?結束語

本研究成功將糖化酶基因導入耐高溫釀酒酵母基因組中，并最終獲得了3株可用于工業發酵驗證的糖化酵母COTYT-H、COTYT-M和COTYT-L。發酵性能測定結果顯示：糖化酵母COTYT-H經真實物料中試驗證可有效節省50%糖化酶的使用，發酵的各項指標與糖化酶不減量的市售釀酒酵母發酵性能一致，達到實際生產對菌株發酵指標的各項要求，可用于乙醇工業化生產。

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