鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）葉藝形成機制的初探

鄭寶強，喬紅娟，李柏君，KAOTachung，張 燕，王 雁＊

(1. 國家林業局林木培育重點實驗室，中國林業科學研究院林業研究所，北京 100091；2. Gao's Orchid Garden，AV Geroldo Azzoni 905 Rio Acima Jundiai SP，Brasil 13215-840；3. 北京市電氣工程學校，北京 100025)

許多植物中都存在綠色葉片出現黃色或白色斑塊的突變體[1-7]，這些突變植株是研究光合作用、葉綠素合成代謝和葉綠體發育等過程的極佳材料[8]。此外，這類表型也是許多觀賞花卉的主要觀賞性狀，是園藝工作者對花卉品種的主要改良和育種目標之一[9-11]。因此，探究葉片黃色或白色的斑化形成機制具有重要的生物學意義和應用價值。

葉綠素是使植物葉片顯綠色的主要色素，其在植物體內的生物合成通路已經得到了詳細描述和報道[12-15]。許多研究表明，葉綠素生物合成途徑中結構基因的表達量變化會直接決定葉綠素在組織中的積累量，從而影響葉片顏色的表型[16-17]。當這些結構基因表達量下降時，會導致中間產物無法被催化成葉綠素，最終使葉片失綠從而產生白色或黃色的斑塊或條紋[15,18-20]；同時，造成組織失綠的具體機制在不同植物之間存在差異。因此，探索不同植物突變體葉片失綠的具體分子機制具有重要的意義，是對相關植物進行葉色園藝性狀改良的理論基礎和依據。

蘭科(Orchidaceae)植物因其獨特的花形、豐富的花色和迷人的花香而世界聞名，其許多種和栽培品種已成為廣受大眾歡迎的觀賞花卉。葉片失綠的突變現象在蘭花中被稱為“葉藝”，其能夠提高蘭花的觀賞價值，是蘭花園藝工作者主要的選育目標之一[21]。但是，目前葉藝在蘭科中的分子機制研究較少，僅在蘭屬（Cymbidium）[20,22-23]和卡特蘭屬（Cattleya）[24]有過相關報道，大多研究主要在生理水平上對葉藝機制進行探索[10,25-29]。近年來，許多石斛屬（Dendrobium）的葉藝突變體在市場上越來越受歡迎。鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）在自然環境和人工栽培條件下常出現葉藝現象[30]，這些葉藝鐵皮石斛是石斛品種改良與培育的優質種質資源。此外，鐵皮石斛的高質量基因組已經公布[31]，這為研究鐵皮石斛葉藝現象的分子機制提供了便利與基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試材料為鐵皮石斛葉藝突變體的無性系，其葉片上有大面積白色斑塊或條紋。本研究所用材料都培養在中國林業科學研究院溫室中，采光為自然光照，正常栽培管理。

1.2 顯微結構觀察

1.2.1 葉片顯微結構觀察 分別取正常鐵皮石斛（WT）、葉藝鐵皮石斛葉子綠色組織（YYG）、葉藝鐵皮石斛葉藝白色組織（YYW），用雙面刀片快速切成薄片，放入有蒸餾水的玻璃皿中。選擇其中最薄的透明度最大的薄片做成臨時切片，在光學顯微鏡（Olympus，日本）下觀察和拍照。

1.2.2 葉綠體超顯微結構觀察 根據Li等[15]的方法，將實驗材料制備成切片；利用透射電鏡（JEOL，日本）對切片中的葉綠體顯微結構進行觀察和拍照。

1.3 葉綠素及其前體物質含量的測定

本研究采用邵勤等[32]的葉綠素提取和含量計算方法，對不同處理稱取等量實驗材料并研磨至粉末，然后利用80%丙酮進行葉綠素萃取。通過UV2310Ⅱ分光光度計分別測定提取液波長在663、646、470 nm下的OD值。最后，根據相關計算公式得到不同實驗處理的葉綠素含量。根據Bogorad[33]的方法對實驗樣品中膽色素原(Porphobilinogen,PBG)、尿 卟 啉 原 III (Uroporphyrinogen Ⅲ,UrogenIII)和糞卟啉 III(Coproporphyrinogen Ⅲ,CoprogenⅢ)進行提取和含量測定。根據Lee等[34]的方法對實驗樣品的原卟啉IX (Protoporphyrin IX,Proto IX)、鎂原卟啉IX(Mg-Protoporphyrin IX, Mg-Proto IX)和原葉綠素酸酯(Protochlorophyllide,Pchlide)進行提取和含量測定。每處理進行3個生物學重復測定，并利用Omiscshare tools (http://omicshare.com/tools/)對數據進行Student's pairedt-test。

1.4 葉綠素合成相關基因的qRT-PCR定量

1.4.1 總RNA提取和質量檢測 利用改良的SDS法[35]提取實驗樣品中的總RNA。利用NanoDrop 2000微量分光光度計（Thermo Scientific Inc., USA）對RNA的質量進行檢測，OD260/280≥1.8、OD260/230≥1.8和濃度大于100 ng·μL-1的RNA被用于下一步的反轉錄。

1.4.2 相關基因的qRT-PCR定量 利用EasyScript One Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix qPCR（全式金，中國）反轉錄試劑合成RNA的cDNA第一鏈。從已發表的鐵皮石斛基因組[31]中找與葉綠素合成相關的基因，利用NCBI的Primer-BLAST進行引物設計（表1）。以Dc18S作為內參基因對數據進行標準化。根據TaKaRa TB GreenTMPremixEx TaqTM試劑盒（TaKaRa, Japan）使用說明書設置LightCycler480 System（Roche,USA）的qRT-PCR運行程序進行基因的qRT-PCR定量。每個基因在每個處理中進行3個生物學重復測定，并利用Omiscshare tools (http://omicshare.com/tools/)對數據進行Student's pairedt-test。

表1 葉綠素合成相關基因的qRT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of chlorophyll biosynthesis related genes for qRT-PCR

1.5 數據分析

利用SPSS 13.0與Excel 2010對生理指標進行統計和方差分析，基因定量采用Comparative CT(-ΔΔCt)法進行計算[36]。

2 結果與分析

2.1 葉藝突變體的顯微觀察比較

正常的鐵皮石斛葉片為全綠色（圖1a），而葉藝鐵皮石斛的葉片上則出現了大面積的白色條紋或斑塊（圖1b、c）。對葉片橫切面的顯微觀察結果顯示：正常鐵皮石斛（WT）和葉藝鐵皮石斛葉片綠色組織（YYG）的部位中充滿了綠色細胞（圖1d、e），而葉藝鐵皮石斛葉藝白色組織（YYW）的部位中則基本上看不到綠色細胞（圖1f）。對這些組織細胞的超顯微結構觀察顯示：WT和YYG的葉綠體呈飽滿的半球形，其體內富含排列整齊的基粒片層和類囊體基粒，淀粉顆粒少（圖2）；而YYW的葉綠體則呈干癟的三角形，體內基粒片層和類囊體基粒數量稀疏且排列無規則，淀粉顆粒多（圖2）。這些結果顯示葉子呈綠色的WT和YYG富含大量的綠色葉綠體且具有相似的葉綠體細胞結構，而YYW則與前兩者相反。

圖1 葉藝和正常鐵皮石斛的形態特征和葉片顯微觀察Fig. 1 The morphological characteristics and microscopic structure of normal and mutant D. catenatum leaves

圖2 石斛葉片葉綠體的超顯微結構觀察Fig. 2 The ultrastructure of chloroplast in D. catenatum leaves

2.2 葉綠素、葉綠素合成前體物質和類胡蘿卜素的含量測定

葉綠素和類胡蘿卜素含量測定顯示：WT和YYG之間的葉綠素a、葉綠素b、總葉綠素和類胡蘿卜素含量無明顯差異，但它們都顯著高于YYW（圖3）。這一結果顯示YYW的葉綠素合成受到了阻礙，并支持了其白化表型特征和顯微觀察YYW中幾乎沒有綠色細胞的結果。

圖3 野生型和突變型鐵皮石斛葉片中光合色素的含量Fig. 3 Photosynthetic pigments content of WT and mutant leaves

葉綠素合成的上游中間代謝物中，YYW的膽色素原含量是WT的84%，而尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉原Ⅲ含量則分別是WT的109%和137%（圖4）。在葉綠素合成下游中間前體物質中，WT和YYG的原卟啉IX、鎂原卟啉IX和原葉綠素酸酯含量是YYW的4.9～17.1倍，而它們二者之間的差距相較于YYW則較小（圖4）。糞卟啉原Ⅲ是原卟啉IX和鎂原卟啉IX重要合成前體[15]。因此，這些結果顯示：YYW在合成葉綠素的過程中，原卟啉IX的合成受到了阻礙，中間產物無法正常流向葉綠素合成。

2.3 葉綠素生物合成途徑中結構基因的表達量測定

WT、YYG和YYW中葉綠素生物合成途徑中8個結構基因的qRT-PCR結果（圖5）顯示：YYW中的尿卟啉原脫羧酶（Uroporphyrinogen decarboxylase, DcHEME）、糞卟啉原氧化脫羧酶（Coproporphyrinogen III oxidase, DcHEMF）、原卟啉原氧化酶（Protoporphyrinogen oxidase, DcHEMG）和鎂螯合酶H和鎂螯合酶H亞基（Mg chelatase H subunit, DcCHLH）的表達量都顯著低于WT和YYG。羥甲基后膽色素原合酶（Porphobilinogen deaminase, DcHEMC）的表達量在三者之間并無明顯差異，而YYG和YYW中的膽色素原合酶（Porphobilinogen Synthase, DcHEMB）、鎂螯合酶D亞基（Mg chelatase D subunit, DcCHLD）和鎂原卟啉IX甲基轉移酶（Mg protoporphyrin IX methyltransferase, DcCHLM）的表達量則都顯著低于WT。值得注意的是，HEMF和HEMG是合成原卟啉IX的關鍵酶，而CHLH和CHLD則是合成鎂原卟啉IX的關鍵酶[15]。

3 討論

大多數植物的葉片為綠色，但許多植物都有葉片白化的突變體，而這種葉片出現白化的突變現象是許多觀賞植物的重要觀賞性狀，具有很高的觀賞價值[15]。葉綠素是植物進行光合作用的主要物質，同時它也是使植物組織呈現綠色的重要色素[37]。在許多植物的白化突變體中，其葉子的白化區域都出現了葉綠素積累量顯著下降[13,38-40]。本研究通過顯微觀察發現，YYW基本沒有綠色細胞，同時其葉綠體細胞結構畸形且體內基粒片層和類囊體基粒數量稀疏且排列無規則。許多研究表明，植物葉色的突變都伴隨著葉綠體細胞結構的改變和體內類囊體基粒的無序排列[11,41-42]。因此，葉綠素含量的下降是導致葉藝鐵皮石斛葉片出現白色條紋或斑塊的主要原因。此外，糞卟啉原Ⅲ在YYW中的含量顯著高于WT和YYG，而糞卟啉原Ⅲ的下游產物原卟啉IX、鎂原卟啉IX和原葉綠素酸酯在WT和YYG中的含量是YYW的4.7～17.1倍。這進一步表明，YYW的葉綠素合成從糞卟啉原Ⅲ下游產物合成開始就受到了阻礙，而這可能是導致YYW中葉綠素無法正常合成的主要原因。

葉綠素生物合成途徑中關鍵酶編碼基因表達量的變化會直接影響葉綠素在植物組織的積累量，從而改變植物組織的顏色表型[15-17,43]。本研究中，葉綠素合成途徑中的DcHEMF、DcHEMG、DcCHLH和DcCHLM在YYW中的表達量顯著低于正常葉片。在葉綠素合成途徑中，糞卟啉原Ⅲ經過HEMF和HEMG的催化后會生成原卟啉，然后分別通過CHLD、CHLH和CHLI進一步形成鎂原卟啉IX[17]。值得注意的是，葉藝鐵皮石斛中糞卟啉原Ⅲ含量顯著高于正常葉片，而原卟啉和鎂原卟啉IX含量則顯著低于正常葉片。前人研究表明，金魚草（Antirrhinum majus）葉片的黃綠表型是由Tam3插入使ChlH基因失去活性所導致[44]。水稻（Oryza sativa）葉片的突變體中，由于T-DNA插入到line 9-07117的鎂螯合酶大亞基ChlH中，使其無法正常轉錄翻譯，導致水稻葉片失綠[18]。銀杏（Ginkgo biloba）葉片的黃化突變體中，GbPPO、GbCHLD、GbCHLH和GbCHLI在黃化葉片中的表達量下調，同時其糞卟啉原Ⅲ含量顯著高于正常葉片，而原卟啉IX和鎂原卟啉IX的含量則相反[15]。本研究中，DcHEMF、DcHEMG和DcCHLH在YYW中的低表達使糞卟啉原Ⅲ無法正常流向葉綠素合成，造成葉綠素的積累量減少，最終導致葉片失綠。這些研究結果為今后石斛屬的葉藝性狀改良提供了理論依據和分子基礎。

圖4 野生型和突變型鐵皮石斛葉片中葉綠素合成的中間產物含量Fig. 4 The content of chlorophyll intermediates in WT and mutant leaves

圖5 野生型和突變體石斛葉片中葉綠素合成相關基因的表達量變化Fig. 5 The relative expression of some chlorophyll biosynthesis relative genes in WT and mutant leaves

4 結論

DcHEMF、DcHEMG和DcCHLH在葉藝鐵皮石斛葉片白色區域中的低表達使糞卟啉原Ⅲ無法正常流向葉綠素合成，這導致了葉綠素含量的下降，是使鐵皮石斛出現葉藝表型的主要原因。