Hippo信號通路中TAZ、YAP在三陰性乳腺癌中的表達及意義

祝景偉，佟經偉，許培權

蚌埠醫學院第一附屬醫院(蚌埠 233004)

Hippo信號通路是近年來首先在果蠅中發現的一條高度保守的抑制性信號通路，通過抑制細胞增殖和促進細胞凋亡來調節器官的發育[1]。越來越多的研究表明，該信號通路的異常與多種腫瘤的發生有關[2-6]。具有PDZ結合基序的轉錄共活化蛋白(Transcriptional co-activator with PDZ-binding motif,TAZ)和Yes相關蛋白(Yes-associated protein,YAP)是Hippo信號通路的兩個核心下游轉錄調控分子，在多種腫瘤中存在過表達現象[2-3，7-9]。三陰性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)是指雌激素受體(Estrogen receptors,ER)、孕激素受體(Progesterone receptors,PR)和人類表皮生長因子受體2(Human epidermal growth factor receptor 2,Her-2)均為陰性的乳腺癌。TNBC惡性程度高、侵襲性強、易遠處轉移、預后差、對內分泌及靶向治療反應不敏感，目前化療仍為TNBC患者主要的全身治療手段。大部分接受化療的患者面臨著毒性難以耐受與治療后疾病進展的難題，而且轉移性乳腺癌在經過幾線治療后，化療的有效率愈發低下。因此，尋找有效的靶向治療分子，對TNBC的早期診斷及治療至關重要。本研究通過免疫組織化學方法檢測TAZ、YAP蛋白在TNBC組織中的表達，探討TAZ、YAP蛋白與TNBC患者的臨床病理特征的關系，為TNBC的靶向治療提供理論依據。

資料與方法

1 一般資料 收集2013年11月至2014年12月蚌埠醫學院第一附屬醫院腫瘤外科收治的TNBC患者30例為研究組，取同期非三陰性乳腺癌(Non-triplenegative breast cancer,non-TNBC)患者30例做對照組。所有患者均為女性，年齡28～72歲，中位年齡47歲。腫瘤體積大小≤2 cm 30例，2～5 cm 26例，>5 cm 4例。無淋巴結轉移28例，有淋巴結轉移32例。TNM分期：I期15例，Ⅱ期29例，Ⅲ期16例。組織學分級：Ⅰ-Ⅱ級38例，Ⅲ級22例。所有患者術前均未接受過放療、化療、靶向及內分泌治療，入院后經我院病理科確診為浸潤性乳腺癌后行乳腺癌改良根治術。兩組患者臨床病理資料對比見表1。

表1 兩組一般資料對比(例)

2 TAZ和YAP檢測 兔抗人TAZ抗體和重組YAP抗體購自美國Abcam公司(ab110239)。所有標本均經10%中性福爾馬林固定，采用免疫組織化學標記(SP法)進行檢測。石蠟標本常規切片后脫蠟、水化、蒸餾水沖洗，用PBS(pH值=7.4)沖洗3次，每次3 min。高溫高壓對組織抗原進行修復，冷卻至室溫，PBS緩沖液浸泡5 min，重復3次。3%過氧化氫室溫下孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加第一抗體(TAZ抗體/YAP抗體)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，每次3 min，甩去PBS，滴加二抗(根據Abcam公司二抗試劑盒說明書進行操作)，PBS沖洗3次，每次3 min。甩去PBS，滴加DAB顯色液，蒸餾水沖洗，進行復染、脫水、透明、自然干燥后封片。

3 結果判斷標準 本實驗中病理檢測結果的判斷由我院病理科兩名高年資副主任醫師擔任。TAZ和YAP蛋白表達在細胞核和(或)胞質中，并呈棕黃色顆粒為陽性。隨機選取5個高倍鏡(200倍)視野，根據細胞著色比例和染色強度進行評價。細胞著色比例：<10%記為0分，10%～25%記為1分，26%～50%記為2分，51%～75%記為3分，>75%記為4分；染色強度：無著色記為0分，淡黃色記為1分，黃色記為2分，棕黃色記為3分。上述兩項結果相乘，得分<3為陰性，≥3為陽性。

4 統計學方法 采用SPSS 16.0統計學軟件包進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，相關性分析采用Spearman相關分析法。P<0.05為差異具有統計學意義。

結 果

1 TAZ在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達 30例研究組癌組織中，TAZ陽性率為56.7%，30例對照組癌組織中TAZ陽性率為16.7%。研究組癌組織中TAZ陽性率高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表2。

A：TAZ在研究組中的陽性表達；B：TAZ在研究組中的陰性表達；C：TAZ在對照組中的陽性表達；D：TAZ在對照組中的陰性表達

表2 兩組癌組織中TAZ的表達

2 YAP在三陰性乳腺癌組織和非三陰性乳腺癌組織中的表達 30例研究組癌組織中，YAP陽性率為73.3%，30例對照組癌組織中YAP陽性率為43.3%。研究組癌組織中YAP陽性率高于對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖2、表3。

表3 兩組癌組織中YAP的表達

A：YAP在研究組中的陽性表達；B：YAP在研究組中的陰性表達；C：YAP在對照組中的陽性表達；D：YAP在對照組中的陰性表達

3 TAZ和YAP在三陰性乳腺癌組織中的表達與臨床病理參數之間的關系 TAZ和YAP的陽性表達均與腫瘤大小和組織學分級有關，差異具有統計學意義(P<0.05)；而與發病年齡、臨床病理分期、淋巴及轉移情況無關，差異無統計學意義(P>021:00 2020-9-9.05)。見表4。

表4 研究組中TAZ和YAP的表達與臨床病理參數的關系

4 TAZ和YAP在三陰性乳腺癌組織中表達的相關性 在研究組中，TAZ和YAP共同陽性表達的有16例，共同陰性表達的有7例。根據Spearman相關分析結果顯示，TAZ和YAP蛋白在研究組中的表達呈正相關(r=0.537,P<0.05)。

討 論

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，在形態學、分子生物學、臨床表現以及治療反應性上具有高度異質性。TNBC作為乳腺癌的一種亞型，占所有乳腺癌的15%～20%[10]，具有與其他乳腺癌亞型不同的臨床病理特征。常表現為：發病年齡較輕、腫瘤直徑大、組織學分級高、腋窩淋巴結常陰性、易復發和遠處轉移、生存時間短等特點[11]，目前尚無標準的治療方案。本組資料顯示，發病年齡最輕(28歲)的發生在研究組，且年齡≤45歲的患者多于對照組；腫瘤直徑常>2 cm、淋巴結轉移率不高，與以上報道基本一致。

Hippo信號通路在進化上是一條高度保守的抑制性信號通路。1995年，兩個實驗室在果蠅中運用遺傳學篩選尋找腫瘤抑制基因時幾乎同時發現了第一個Hippo信號通路成員Wts[12-13]，其主要負責編碼NDR(Nuclear Dbf2-related)家族蛋白激酶，Wts突變導致組織過度生長。此后研究發現了Hippo信號通路的其他核心成員，包括Sav(Salvador)、Hpo(Hippo)、Mats(Mob as tumer suppressor)、Yki(Yorkie)。Hippo信號通路的核心成員在哺乳動物中都有相對應的同源蛋白分子，Hpo、Sav、Mats、Wts、Yki在哺乳動物中對應的同源蛋白分別是MST1/2(Mammalian Sterile 20-like kinases 1/2)、SAV1(Salvador homolog 1)、MOB1(MOBKL1A/MOBKL1B)、LATS1/2(Large tumor suppressor kinases 1/2)和轉錄共激活因子TAZ/YAP。 TAZ和YAP是Hippo信號通路的兩個核心下游轉錄調控分子，屬于同源蛋白，具有相似的結構和功能。在上游信號因子的作用下，活化的MST1/2和SAV1磷酸化LATS1/2、MOB1并使其相互結合形成復合物，磷酸化TAZ/YAP，TAZ和YAP在細胞質中被磷酸化后與14-3-3蛋白結合，進一步被泛素化降解，參與正常組織代謝[14-15]；若該通路被阻斷或失活，TAZ和YAP在胞質中未被磷酸化則進入細胞核中，與TEA域家族成員(TEA domain family members,TEAD)等轉錄因子結合，從而調控靶基因的表達，參與非正常的調節與代謝，影響細胞的增殖、凋亡和侵襲[16-17]。

目前研究發現，在乳腺癌、非小細胞肺癌、胃癌、肝癌、結直腸癌和口腔鱗狀細胞癌等多種人類腫瘤中都存在Hippo信號通路的異常，表明Hippo信號通路參與腫瘤發生發展的多個環節。TAZ和YAP是Hippo信號通路的兩個核心效應分子，研究發現，TAZ在口腔鱗狀細胞癌中高表達，且高表達的TAZ與腫瘤大小、病理學分級、淋巴結轉移等密切相關[4]；在胃癌中高表達的TAZ可通過促進血管內皮生長因子的表達，進而促進胃癌血管生成的能力[2]；而在非小細胞肺癌中，YAP通過調控長鏈非編碼RNA的表達促進癌細胞的增值和遷移[18]。此外，TAZ和YAP的表達異常與多種腫瘤的耐藥密切相關。在非小細胞肺癌中，YAP在吉西他濱、紫杉醇和順鉑等化療藥的耐藥中表達異常[19]；在乳腺癌中，過表達的TAZ導致癌細胞對紫杉醇耐藥，而沉默TAZ可增加乳腺癌細胞對紫杉醇的敏感性，而且TAZ被用來維持乳腺癌干細胞的特性，并導致這些細胞對紫杉醇和多柔比星的耐藥性[20]。本研究結果顯示：TAZ在TNBC組織中的陽性表達率為56.7%，高于non-TNBC組織(16.7%)，而YAP在TNBC組織中陽性表達率高達73.3%，也高于non-TNBC組織(43.3%)，提示TAZ和YAP與TNBC的發生發展密切相關；TAZ和YAP在腫瘤直徑大于2 cm的TNBC組織中表達較高；TNBC組的組織學分級以Ⅱ、Ⅲ級為主(29/30)，TAZ和YAP在分化較差的組織中陽性表達率高。腫瘤大小、組織學分級是公認的乳腺癌預后因素，TAZ和YAP的表達與其相關，提示TAZ和YAP可能與TNBC的惡性程度高、預后差的特征有一定的相關性。

TNBC惡性程度高、侵襲性強，與其他類型乳腺癌相比具有較差的預后。本文通過免疫組織化學法檢測了60例乳腺癌組織中TAZ、YAP蛋白的表達，發現兩者高表達于TNBC組織中，且與腫瘤大小、組織學分級有關；另外，在TNBC中TAZ和YAP的表達呈正相關，說明兩者在三陰性乳腺癌的發生發展中可能具有相互協同作用。我們可以認為Hippo信號通路在TNBC的發生發展中扮演著重要角色。但本次實驗的最大不足是樣本量過少，在后續研究中需要進行大樣本、多中心統計驗證。因此，闡明Hippo信號通路在TNBC發生發展中的作用，為靶向TNBC的治療提供新的方向。