卵巢漿液性癌組織中同源異型蛋白-6和白細(xì)胞分化抗原147表達(dá)及與細(xì)胞增殖相關(guān)性研究*

王 莉,蔡 旺

錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(錦州121001)

卵巢漿液性癌臨床常見，病變分為低級別和高級別，其形成的分子遺傳學(xué)通路可能不完全相同，但是其病變的形成均與腫瘤高增殖狀態(tài)相關(guān)[1]。Ki67是臨床標(biāo)記增殖的經(jīng)典蛋白，其高表達(dá)代表腫瘤具有較高的增殖活性及細(xì)胞生長特征，高增殖性的腫瘤生長迅速。同源異型蛋白-6(Sine oculis homeobox homolog-6,SIX6)是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，其在腫瘤中表達(dá)升高，能調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[2]。白細(xì)胞分化抗原147(Cluster of differentiation147,CD147)是超免疫家族成員，近年研究認(rèn)為CD147與SIX家族的相關(guān)成員具有可能結(jié)合的位點(diǎn)，兩者可能有協(xié)同作用[3]。本文探討卵巢漿液性癌組織中SIX6和CD147的表達(dá)及與細(xì)胞增殖的相關(guān)性。

資料和方法

1 一般資料 收集2016年1月至2017年5月在確診為卵巢漿液性癌手術(shù)治療的患者85例作為研究組。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①由病理醫(yī)師確診，符合WHO卵巢漿液性癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②臨床資料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有嚴(yán)重內(nèi)科疾病；②雙原發(fā)癌或多原發(fā)癌；③有放、化療史?；颊吣挲g35～87歲，中位年齡57.7歲。腫瘤最大徑2～16 cm，低級別漿液性癌29例，高級別漿液性癌56例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例；單側(cè)發(fā)生23例，雙側(cè)發(fā)生62例。收集同期85例卵巢漿液性囊腺瘤患者作為對照組，年齡35～85歲，中位年齡61.3歲。腫瘤最大徑3～11 cm。均留取術(shù)后石蠟包埋組織。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者或家屬簽定知情同意書。

2 研究方法

2.1 SIX6、CD147和Ki67表達(dá)的檢測：術(shù)后標(biāo)本常規(guī)取材，應(yīng)用中性福爾馬林固定后脫水、石蠟包埋。切取4 μm切片。試劑均購自武漢博士德生物技術(shù)公司。SIX6、CD147均為濃縮液，先行預(yù)實(shí)驗(yàn)，選擇最佳顯色的濃度用于正式實(shí)驗(yàn)(SIX6為1∶250，CD147為1∶300)。Ki67為工作液。應(yīng)用免疫組化SP法進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按說明書操作，DAB顯色，做好質(zhì)控工作。

2.2 SIX6、CD147和Ki67的結(jié)果判定：SIX6和CD147陽性部位是細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)。共選擇3個(gè)400倍視野進(jìn)行觀察。以二維評分作為計(jì)量結(jié)果。著色強(qiáng)度：無著色為0分；弱為1分，中為2分，強(qiáng)為3分。陽性判定：以<5%為0分，5%～10%為1分，以11%～30%為2分，以31%～50%為3分，以>50%為4分。兩者相乘為最終評分，分值范圍0～12分，以≤3分為陰性，以>3分為陽性，計(jì)算陽性率。Ki67陽性部位是細(xì)胞核，共選擇3個(gè)400倍視野，計(jì)算陽性率。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)數(shù)資料以[例(%)]表示，組間比較行卡方檢驗(yàn),應(yīng)用Spearman相關(guān)分析及生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 兩組中SIX6、CD147表達(dá)陽性率比較 見表1、圖1。研究組中SIX6、CD147陽性率明顯高于對照組,兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：SIX6在漿液性癌中陽性表達(dá)；B：CD147在漿液性癌中陽性表達(dá)

表1 兩組中SIX6和CD147表達(dá)陽性率比較[例(%)]

2 研究組不同臨床病特征分組中SIX6和CD147陽性率比較 見表2。研究組中SIX6和CD147在不同腫瘤的最大徑、病變級別分組的表達(dá)中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。SIX6在有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的表達(dá)中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 研究組不同臨床病特征分組中SIX6和CD147陽性率比較

3 研究組中SIX6和CD147表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示研究組中SIX6和CD147的表達(dá)具有正相關(guān)性(r=0.65，P=0.0154)。

4 研究組SIX6、CD147與Ki67表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示研究組中SIX6和Ki67(r=0.61，P=0.0112)、SIX6和Ki67(r=0.59，P=0.0121)均具有正相關(guān)性。

5 研究組SIX6、CD147的表達(dá)與生存時(shí)間的相關(guān)性 本組患者均進(jìn)行術(shù)后3年(36個(gè)月)的隨訪。其中3例失訪。1例因意外(車禍)死亡，列為刪失值。術(shù)后生存時(shí)間為5～36個(gè)月。生存分析顯示研究組中SIX6(χ2=4.35，P=0.021)和CD147(χ2=4.99，P=0.013)的表達(dá)與生存時(shí)間相關(guān)，即研究組SIX6和Ki67高表達(dá)患者的生存時(shí)間短，預(yù)后差。

討 論

卵巢漿性液性腫瘤目前認(rèn)為來源于輸卵管上皮或卵巢表面上皮，其病變級別與來源有關(guān)。上皮細(xì)胞的異型增生是腫瘤形成的重要前提，高級別腫瘤的惡性程度高[4]。有研究顯示高級別漿液性癌病變發(fā)現(xiàn)時(shí)常表現(xiàn)為腹腔中彌漫的轉(zhuǎn)移灶，病變具有較強(qiáng)的侵襲性及彌漫性生長的特點(diǎn)[1]。漿液性癌是高級別的腫瘤，DNA復(fù)制的起始和抑癌基因的失活是增殖的重要環(huán)節(jié)，此時(shí)增殖相關(guān)基因啟動(dòng)細(xì)胞的增殖，引起細(xì)胞活性增強(qiáng)[5]。

Ki67是標(biāo)記增殖較特異的蛋白，也是臨床標(biāo)記增殖指數(shù)的常用抗體，其具有穩(wěn)定、客觀，能準(zhǔn)確反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的增殖狀態(tài)。SIX6是轉(zhuǎn)錄因子的一種，與多種組織器官的發(fā)育有關(guān)[6-7]。SIX6在細(xì)胞惡變后表達(dá)明顯升高，與癌基因的作用相似。研究顯示SIX6可以促進(jìn)增殖細(xì)胞因子的表達(dá)，如CyclinAl、CyclinDl等[8-9]。SIX6可能對調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附有一定作用，主要是對E-cadherin和EP-CAM的調(diào)控作用[10]。CD147在腫瘤形成過程中可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的黏附和腫瘤細(xì)胞的遷移。CD147由 269個(gè)氨基酸組成，其N端有高度的糖基化結(jié)構(gòu)區(qū)，而糖基化的異常能使不同蛋白質(zhì)發(fā)揮不同的功能。糖基化方式與激活E-cadherin介導(dǎo)的黏附作用有關(guān)[11-12]。研究認(rèn)為SIX6與CD147具有可能的結(jié)合位點(diǎn)[13]。表皮生長因子受體(EGFR)、缺氧誘導(dǎo)因子等能引起CD147活化，使癌細(xì)胞的侵襲和增殖能力增強(qiáng)[14]。

本研究結(jié)果顯示卵巢漿液性癌組織中SIX6和CD147的陽性率明顯增高，提示兩者具有癌基因樣的作用。研究組中SIX6和CD147的表達(dá)與腫瘤的最大徑、病變級別有關(guān)，提示兩者高表達(dá)參與腫瘤的進(jìn)展，即SIX6和CD147高表達(dá)后對局部組織和周圍鄰近器官形成明顯的破壞作用，對卵巢周圍組織的侵襲有重要的促進(jìn)作用。SIX6與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示SIX6的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤具有較高轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。SIX6和CD147具有正相關(guān)性，提示兩者具有協(xié)同正向作用，也間接證實(shí)了兩者具有可能的結(jié)合位點(diǎn)，但是兩者是否具有靶向關(guān)系尚需要應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)來證實(shí)。SIX6和CD147均對腫瘤細(xì)胞的增殖有促進(jìn)作用。SIX6在腫瘤中的作用可能較為復(fù)雜，SIX6既具有直接調(diào)控細(xì)胞增殖的作用，又具有通過調(diào)節(jié)CD147參與細(xì)胞活性和改變細(xì)胞間連接的作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生和轉(zhuǎn)移。CD147高表達(dá)可以降低E-cadherin的表達(dá)，引起細(xì)胞的黏附性減弱，細(xì)胞連接松散，腫瘤細(xì)胞易于離開原發(fā)灶，在原發(fā)灶外的器官定植，形成轉(zhuǎn)移瘤[15]。SIX6可能是CD147的上游因子，引起細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的進(jìn)展。CD147與轉(zhuǎn)移的作用在文獻(xiàn)中有報(bào)道[16-17]，但是本實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)CD147與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及對在側(cè)卵巢受累中的作用，這可能與CD147的表達(dá)有組織特異性有關(guān)[18-19]。本研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合檢測SIX6和CD147的表達(dá)與腫瘤的預(yù)后有關(guān)，提示SIX6和CD147可能是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)，后續(xù)應(yīng)加大樣本量進(jìn)行證實(shí)。

總之，SIX6和CD147在卵巢漿液性癌組織中高表達(dá)，參與腫瘤的形成和進(jìn)展。SIX6和CD147對細(xì)胞的增殖有一定作用。SIX6和Ki67的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)。