多重引物HRMA對成骨不全患者COL1A1/2基因突變的篩查與分析

楊立 張天可 周懷蔚 鞠明艷 白雪 李克秋 任秀智 李光*

1.天津醫科大學基礎醫學院，天津 300070

2.天津市天津醫院檢驗科，天津 300211

3.天津市武清區人民醫院骨科三病區，天津 301700

成骨不全(osteogenesis imperfecta,OI)也稱為脆性骨病，是一種常染色體顯性遺傳病，主要由于COL1A1或COL1A2兩個基因發生突變所致，分別編碼了I型膠原的pro-α1和pro-α2兩條肽鏈，一旦發生基因突變，將導致I型膠原合成不足及其三螺旋膠原結構發生異常[1-2]。成骨不全在兒童中發病率接近于1/10 000，臨床表現多種多樣，很難確定基因型和表現型之間的關系[3-4]。90%患病家系的基因突變類型為點突變(包括無義突變、錯義突變等)，并且隨機發生于COL1A1的51個外顯子和COL1A2的52個外顯子上，每個外顯子之間的突變類型又有所不同，使得突變區域結構相當龐大復雜；此外，COL1A1和COL1A2基因片段較長，外顯子眾多，沒有突變熱點，尤其是COL1A2較易形成發卡結構，這些都為突變篩查增加了難度[5-6]。當前對于成骨不全基因突變篩查，傳統PCR操作簡便、結果可靠；傳統高分辨熔解曲線分析(high resolution melting analysis，HRMA)靈敏度高、特異性強、簡單快速、高效經濟,檢測不受堿基位點的局限,可同時對等位基因的變化進行識別；qPCR-HRMA同時具備兩者的特點。上述篩查方法均只針對于單對引物，對于擁有眾多外顯子的COL1A1和COL1A2，篩查起來工作量較大，耗時、耗材、耗費用。

本研究在傳統HRMA的基礎上，建立了多重引物HRMA的方法，將滿足一定條件的兩對引物進行配對，并與單個樣本DNA混合作為擴增體系，可同時對COL1A1或COL1A2的兩個外顯子進行突變篩查。并用該方法成功篩查了兩例OI患者在COL1A1、COL1A2上的突變。多重引物HRMA不僅可以用于OI患者基因突變的篩查，也為其他遺傳病致病基因的篩查提供了新思路。這類遺傳病往往都是常染色體顯性遺傳病，致病基因上具有較多的外顯子，而且沒有突變熱點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

兩例OI患者和50例正常對照樣本均來源于天津市天津醫院，50例正常對照樣本與鞠明艷等[7]的研究一致，包括28名男性，22名女性，平均年齡9歲，均為漢族人群，個體間無血緣關系。收集OI患者的相關臨床資料，包括家族史、骨骼畸形情況、鞏膜顏色和X線表現等等。實驗項目在OI患者或其家屬簽訂知情同意書下進行，并且得到了天津市天津醫院倫理委員會批準。

先證者1：男，9歲，患者身高120 cm，藍色鞏膜，牙質發育不全，牙齒稀疏，共發生15次骨折，初次骨折為出生時，四肢向外彎曲畸形。X線檢查顯示：左脛腓骨骨密度降低，骨干變細，骨皮質變薄，骨干向脛側彎曲變形；左股骨下端斷裂，髓內釘固定，臨床診斷為Ⅳ型OI。先證者父親，身高165 cm，在2歲時曾發生骨折，淺藍色鞏膜。先證者哥哥，身高145 cm，初次骨折發生于出生時，藍色鞏膜，齲齒。先證者母親無相關癥狀。

先證者2：女，11歲，患者身高150 cm，淺藍色鞏膜，牙質發育不全，牙齒稀疏，雞胸，共發生20次骨折，初次骨折為出生后35 d，四肢向外彎曲畸形。X線片顯示：左脛腓骨骨密度減低，骨皮質變薄，骨小梁稀疏，脛腓骨骨干彎曲變形；左右股骨骨密度降低，向外側彎曲變形，骨干變細，骨皮質變薄；右股骨骨干、左右脛骨髓內釘固定，骨干變細，骨密度減低，臨床診斷為Ⅳ型OI。先證者母親，身高153 cm，在3歲時曾骨折兩次，均為小腿骨折，淺藍色鞏膜。先證者父親無相關癥狀。兩個先證者的X線片、家系調查及臨床表現分別見圖1～圖3、表1。

圖1 先證者X線片注：A、B、C X線片取自于先證者1；D、E、F X線片取自于先證者2。Fig.1 X-rays of the probands

圖2 家系圖注：家系1(A)的Ⅱ-2是先證者1；家系2(B)的子代是先證者2；□○：分別為正常男性、正常女性；■●：分別為患病男性、患病女性。Fig.2 Pedigree chart

圖3 先證者臨床表現注：A、B照片取自于先證者1；C、D照片取自于先證者2。兩例先證者均伴有牙質發育不全和藍色鞏膜。Fig.3 Clinical manifestations of the probands

表1 兩例患者的臨床表現Table 1 Clinical presents of the two proband

1.2 方法

1.2.1基因組DNA制備：采集兩例成骨不全患者和50例正常對照人群的靜脈血，EDTA抗凝，-80 ℃進行保存。采用美國AxyPrep血基因組試劑盒提取血液中的樣本DNA，使用NanoDrop 2000核酸定量分析儀(德國)檢測DNA的濃度和純度，保證濃度為(20±2)ng/μL，置于-80 ℃保存備用。

1.2.2引物設計及合成：采用Primer 5.0和Oligo 7.0對COL1A1的51個外顯子和COL1A2的52個外顯子進行引物的雙重分析與設計，使得引物滿足條件：退火溫度60 ℃～64 ℃；長度20～24 bp；產物長度80～280 bp；|ΔG|、|ΔC|<4.5 kcal/mol；將每個外顯子對應的擴增產物Tm值差距為3 ℃～4 ℃，且驗證后無相互干擾的兩對引物設為一組，與單份樣本DNA混合作為擴增體系。對于結構較長的外顯子可以設計兩對或多對引物。引物由上海生工合成。

1.2.3多重引物HRMA篩查分析基因突變：采用QIAGEN(德國)Type-it HRM PCR Kit 400試劑盒。采用基因公司(美國)illumina Eco熒光定量PCR儀，反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s、退火溫度(60 ℃或64 ℃)30 s、72 ℃延伸10 s，40個循環。采用48孔板(美國illumina公司)進行產物合成，每孔總反應體積為10 μL：PCR Master Mix 5 μL，兩對引物各自的上下游引物初始濃度均為10 μmol/L 0.35 μL，樣本DNA為20 ng/μL 1.5 μL，無酶水(北京TIANGEN公司)2.1 μL。HRMA分析條件為95 ℃預處理15 s，熔解溫度為65 ℃～95 ℃，上升速度為0.1 ℃/s，每升高1 ℃采集10次熒光信號，Eco V3.0軟件進行熔解曲線分析，每個樣本重復4～5次。

1.2.4長片段引物擴增與測序：經過多重引物HRMA篩查分析后，HRMA熔解曲線提示存在突變，針對存在突變的基因序列自行設計長片段引物，并與單份正常對照DNA樣本混合作為擴增體系，進行PCR合成。采用Applied Biosystems公司梯度PCR儀(美國)，由上海生工完成測序。

1.2.5產物序列分析：運用GENEBLAST及GENETOOL等軟件分析測序結果，與GENEBANK上的正常序列進行比對分析，確定突變位點和變化的氨基酸編碼序列，在人類突變數據庫中(https://www.le.ac.uk/genetics/collagen/)查找為新的突變類型。

2 結果

2.1 正常對照下多重引物HRMA分析

COL1A1和COL1A2兩個基因共103對引物，將滿足一定條件的引物兩兩配對與單份正常對照樣本DNA混合，作為擴增體系進行HRMA合成，成功配對78個即39對外顯子。另外的25個外顯子未配對成功，成功率為75.73%。其中兩對引物HRMA熔解曲線見圖4。

圖4 正常對照HRMA熔解曲線注：A：COL1A2 exon48、COL1A1 exon41配對合成派生曲線，Tm分別為84.7 ℃、88.1 ℃；B：COL1A2 exon48、COL1A1 exon41配對合成標準曲線，據此判斷有無異常；C：COL1A1 exon16、COL1A1 exon37配對合成派生曲線，Tm分別為86.1 ℃、88.2 ℃；D：COL1A1 exon16、COL1A1 exon37配對合成標準曲線，據此判斷有無異常。Fig.4 High resolution melting analysis curves

2.2 多重引物HRMA篩查2例患者基因突變

提取兩例先證者的DNA樣本，與成功配對的引物混合，作為擴增體系進行HRMA合成。在正常對照下，兩例先證者HRMA熔解曲線見圖5。

圖5 患者HRMA熔解曲線注：A：患者1，WT為野生型，MT為突變型，多重HRMA標準曲線在COL1A1第41外顯子上存在異常，并且提示雜合突變；B：患者1，WT為野生型，傳統HRMA標準曲線在COL1A1第41外顯子上存在雜合突變；C：患者2，WT為野生型，MT為突變型，多重HRMA標準曲線在COL1A1第16外顯子上有異常，并且提示雜合突變：D：患者2，WT為野生型，傳統HRMA標準曲線在COL1A1第16外顯子上存在雜合突變。Fig.5 High resolution melting analysis curves

圖6 先證者測序圖注：箭頭所示分別是先證者1(A)和先證者2(B)的突變位點，兩者的突變類型均是雜合突變。Fig.6 Sequence curves of the proband

2.3 測序結果

采用Applied Biosystems公司梯度PCR儀(美國)進行合成，由上海生工完成測序。測序結果為：先證者1在COL1A1第41外顯子上c.2877delT雜合突變，即cDNA2 877位堿基T缺失，編碼的纈氨酸變成色氨酸；先證者2在COL1A1第16外顯子上c.1028delC雜合突變，即cDNA1 028位堿基C缺失，編碼的脯氨酸變成亮氨酸，與傳統HRMA篩查結果一致。測序圖見圖6。兩種突變類型在人類突變數據庫(https://www.le.ac.uk/genetics/collagen/)中均未見報道。

3 討論

OI主要由于COL1A1和COL1A2發生基因突變導致，這兩個基因分別編碼I型膠原蛋白的pro-α1、pro-α2鏈。兩種肽鏈因基因突變，表達出現異常，導致骨組織質或量的改變，從而引起成骨不全。OI基因突變形式多樣，種類繁多，隨機發生在103個外顯子上，每個OI家系又有自己的“特異突變”[8]，使得傳統PCR篩查突變的工作量大、難度高、成本高、效率低。Gentile等[9]在2012年首次引入qPCR-HRMA篩查OI基因突變，該方法基于擴增產物之間Tm的微小差異及熔解曲線差異來進行突變篩查，具有快速、高效、成本低等優點。2015年，Wang等[10]運用qPCR-HRMA篩查出兩例新的OI突變，再一次證實qPCR-HRMA方法對于篩查OI基因的有效性。本項目研究在qPCR-HRMA的基礎上進行了創新，建立了多重引物HRMA，將103個外顯子所對應的引物按照一定的條件進行兩兩配對，進一步降低了OI突變篩查的工作量，使之減半，提高了效率，降低了成本。并用該方法篩查了兩例OI患者基因突變。

在正常對照樣本下，成功配對了39對即78個外顯子，成功率為75.73%，剩余未配對成功的COL1A1有3個外顯子，COL1A2有22個外顯子，大部分存在于COL1A2。究其原因，可能由于COL1A2上堿基A/T的比例明顯高于G/C的比例，堿基序列的Tm高于COL1A1的堿基序列；另外，由于COL1A2序列較長，結構較為復雜，設計的引物之間較易形成發卡結構，序列之間較易相互干擾。多重引物HRMA熔解曲線相對于單對引物而言有兩個高峰，即代表著兩對引物配對成功，可以說成功配對幾對引物就會出現幾個高峰。這也是該方法的創新之處。

在家系1中，篩查發現先證者1的HRMA標準曲線在COL1A1 41外顯子上存在差異，患者Tm大約為87.5 ℃，正常對照Tm約為88.1 ℃，兩者相差0.6 ℃；HRMA標準曲線提示雜合突變；測序結果為c.2877delT雜合突變，即cDNA2 877位堿基T缺失，編碼的纈氨酸變成色氨酸。該家系中存在著一個令人關注的現象：先證者的突變位點存在于一段致死基因序列上(869位堿基到1001位堿基之間)，該序列與配體結合區域MLBR2密切相關[11]。在家系2中，篩查發現先證者2的HRMA標準曲線在COL1A1 16外顯子上存在差異，患者Tm大約為86 ℃，正常對照Tm約為86.3 ℃，兩者相差0.3 ℃；HRMA標準曲線提示雜合突變；測序結果為c.1028delC雜合突變，即cDNA1028位堿基C缺失，編碼的脯氨酸變成亮氨酸。多重引物HRMA熔解曲線顯示只有在有突變的外顯子上才存在異常，若配對的兩對外顯子上都有突變，則同時存在異常，與傳統HRMA熔解曲線的篩查結果無明顯差異，同時也證實了多重引物HRMA具有一定的可行性。

環境、遺傳及個體差異等共同影響使得OI的基因型與表型的關系還不是很清楚[12]，臨床診斷也僅僅依賴患者的臨床特征和影像學特征[13]。盡管如此，OI分型仍以Sillence分型為主，根據臨床表現和組織病理學主要分為Ⅰ～Ⅳ型，病情嚴重程度也有所不同。所以OI表現型和基因型的關系仍是亟待研究的問題。相反地，對于OI患者突變篩查的方法卻不斷在創新，從傳統PCR到qPCR-HRMA，再到本文中建立的多重引物HRMA，其篩查效率不斷提高，工作量不斷減少，篩查成本也在不斷降低。目前，多重引物HRMA篩查OI患者突變僅適用于兩對引物配對的情況，三對及三對以上配對還有待研究。另外，文章中僅涉及到兩例OI患者的突變篩查，數量有限，多重引物HRMA的有效性和可行性還需要大量樣本進行分析。盡管如此，兩例患者的篩查結果作為新的突變位點，為科研工作者對其他OI患者的研究提供了有用的信息。

總之，多重引物HRMA為成骨不全以及其他遺傳病的突變篩查提供了新的思路。這類遺傳病往往是常染色體顯性遺傳病，基因上存在較多外顯子，而且不具有突變熱點。