女性供者特征對粒細胞集落刺激因子動員的骨髓和外周血混合采集物中造血和免疫細胞組份的影響

尚博菲，孫于謙，王欣玉，常英軍，劉艷榮，王 昱，黃曉軍，趙曉甦

(北京大學人民醫院， 北京大學血液病研究所， 血液系統疾病國家臨床醫學研究中心，造血干細胞移植治療血液病北京市重點實驗室, 北京 100044)

異基因造血干細胞移植(allogeneic stem cell transplantation, Allo-SCT)是治愈白血病有效乃至唯一的手段[1]。造血和免疫重建是移植成功的關鍵環節之一，移植物中的造血和免疫組份與移植后的造血和免疫重建密切相關，獲取足夠數量的移植物組份是保證造血和免疫重建的前提[2-6]。研究顯示移植物中低數量的CD34+細胞是導致非體外去除T細胞的單倍型相合移植后血小板植入延遲的獨立影響因素[4]。Reshef等[6]報道供者CD8+T細胞數量越高，患者接受減低劑量預處理的Allo-SCT后的總體生存率越好。現有資料表明包括年齡、外周血循環中的單核細胞數量等在內的供者特征是影響移植物組份的重要因素[7-11]；然而，此前的研究主要以總體供者人群和兒童供者為研究對象[4, 7, 9-10]，未見單獨分析女性供者對骨髓和外周血混合移植物組份影響的研究報道。本文回顧性分析了111例健康女性供者特征對粒細胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)動員的外周血和骨髓混合移植物中CD34+細胞和免疫細胞亞群的影響。

1 資料與方法

1.1研究對象 納入2014年4月至2017年10月在我院接受G-CSF動員的111名親緣健康女性供者，中位年齡32(3～7)歲，中位體重55(5～25) kg，這些供者都給予G-CSF 5 μ/(kg·d)皮下注射，連續4～5天，第4、5天按照我院常規分別采集骨髓和外周血采集物回輸給患者；同時留取骨髓和外周血采集物各5 ml，取0.5～1 ml 標本6 h內進行活細胞免疫熒光標記。

1.2主要試劑 鼠抗人單克隆抗體包括異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD45、CD8，藻紅蛋白(PE)標記的CD3、CD34，多甲藻葉綠素蛋白(PerCP)標記的CD4、CD45，別藻藍蛋白(APC)標記的CD3以及APC-H7標記的CD14，上述抗體均購自BD公司。

1.3流式細胞術檢測 CD34+細胞和免疫細胞亞群采用多參數流式細胞儀進行檢測，抗體組合：管1包括CD45-FITC、IgG同型對照；管2包括CD45-FITC、CD34-PE；管3包括CD8-FITC、CD3-PE、CD45-PerCP、CD4-APC、CD14-APC-H7。取適量的骨髓和外周血采集物分別加入管1～3中，常溫避光孵育15 min；加入溶血素2 ml室溫避光10 min, 溶解紅細胞。然后1 200 rpm/min離心5 min, 棄上清，用PBS將標記細胞洗滌1次，棄上清，加入150 μl PBS上機檢測。應用BD FACS DIVA 軟件(BD公司的FACS CANTO-Ⅱ型流式細胞儀)分析。采用ISHAGE設門法分析CD34測定管。

1.4統計學方法 應用SPSS 19統計軟件進行分析，組間比較采用χ2檢驗分析，采用Logistic回歸進行多因素分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1供者臨床及骨髓和外周血混合采集物特征 入組的111例健康供者中無孕史的35例，有孕史的76例，其中懷孕1次、2次、3次和4次的分別是34例、30例、9例和3例。其他供者特征，包括年齡、身高、體重以及不同時間點的血常規值包括白細胞(WBC)、淋巴細胞(LYM)、單核細胞(MONO)、血紅蛋白(HB)和血小板(PLT)等，見表1。

所有供者分別采集1 000 ml骨髓和循環10 000 ml外周血；111例健康女性供者骨髓和外周血混合采集物中所含CD34+細胞、CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4-CD8-T細胞和單核細胞數量以供者每公斤體重計算，分別為2.39(0.61～10.33)×106、226.57(96.68～519.96)×106、120.80(47.43～256.08)×106、89.99(22.89～274.24)×106、15.05(2.72～86.13)×106和149.84(30.04～353.79)×106。

2.2111名健康女性供者特征對骨髓和外周血混合采集物組份的影響 以骨髓和外周血混合采集物中的CD34+細胞、CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4-CD8-調節性T細胞和單核細胞的數量為因變量，以懷孕次數、年齡、身高、體重、體表面積、BMI、穩態(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)、骨髓采集當日(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)、外周采集當日(WBC、LYM、MONO、HB、PLT)為自變量。進行多因素Logistic回歸分析，結果顯示BMI、骨髓采集日LYM、外周采集日LYM對CD3+T細胞有影響。外周采集日LYM對CD3+CD4+T細胞有影響。懷孕次數為0、外周采集日LYM、外周采集日PLT對CD3+CD8+T細胞有影響。年齡、BMI骨髓采集日LYM、外周采集日WBC對CD3+CD4-CD8-T細胞有影響。供者特征對骨髓和外周血混合采集物中CD34+細胞的數量無影響。見表2、3。

表2.1 因變量賦值表

表2.2 自變量賦值表

表3 111名健康女性供者特征對骨髓和外周血混合采集物組份影響的多因素分析

3 討 論

本研究發現，與懷孕2次以上的女性相比，未懷孕女性供者骨髓和外周血混合采集物含有更高數量的CD3+CD8+T細胞；與BMI>21.77的患者相比，BMI≤21.77的供者獲得混合采集物含有的CD3+T細胞和CD3+CD4-CD8-T細胞的數量更多；供者外周血采集當日的LYM>3.15×109/L的女性供者混合采集物中含有數量更多的CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD3+CD4-CD8-T細胞的數量較多；年齡≤32的供者較大于32歲供者的混合采集物中的含有的CD3+CD4-CD8-T細胞數量較多；該研究從女性供者特征對移植物組份影響的角度為最佳供者選擇提供了新的證據[2-6]。

我們以前的研究發現年齡是影響骨髓采集物和外周干采集物中CD34+數量的主要因素[7, 9-10]；與這些研究不同[7, 9-10]，本研究并未發現供者年齡是采集物中CD34+細胞的影響因素；上述差異的原因可能與本研究與此前研究入組的人群不同[7, 9-10]，此前的研究入組的是整體健康供者人群，即包括健康兒童、成人，也包括男性和女性[7, 9-10]，而本研究入組的僅僅是健康女性供者。21項女性供者特征均對CD34+細胞數量無影響。分析其可能原因為這4項女性供者特性受到其他17項供者特征的影響。

Wang等[9]發現健康供者總體人群中，外周血干細胞采集當天的LYM數量對骨髓和外周血混合采集物中CD3+T細胞和CD3+CD4+T細胞的數量有影響。本研究發現外周血采集當天的LYM數量不僅對CD3+T細胞有影響，而且還對CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞有影響。Cao等[10]以兒童健康供者為研究對象，結果發現骨髓采集當天的LYM數量對CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞和CD3+CD8+T細胞有影響。而本研究發現骨髓采集當天的LYM數量對CD3+T細胞和CD3+CD4-CD8-T細胞有影響。由于以前的研究[7, 9-10]和本研究中G-CSF的用量和療程相同，人群差異可能是3組健康供者骨髓和外周血混合采集物中T細胞亞群影響因素有差異的根本原因。與此前的研究一致[10]，本研究發現低BMI的女性供者更易采集到的富含CD3+T細胞的骨髓和外周血混合移植物。總之，根據供者外周血采集前的LYM數量、BMI或選擇未懷孕的供者，有助于采集到含高數量CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞或CD3+CD8+T細胞的移植物，進而改善移植預后[6, 12-13]。

本研究還發現年輕、BMI以及骨髓采集當天的LYM數量對采集物中CD3+CD4-CD8-T細胞數量有影響。在總體健康供者人群，年輕和供者體重是骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T細胞數量的影響因素[9]。兒童健康供者人群中，BMI和應用G-CSF前外周血的LYM數量是骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T細胞數量的影響因素[10]。此前研究和本研究中骨髓和外周血采集物中CD3+CD4-CD8-T細胞數量影響因素的差別主要歸因于不同研究之間健康供者人群特征的差別[9-10]；這也為在不同供者人群中依據各自的特征選擇合適的供者以獲取含高數量的CD3+CD4-CD8-T細胞的移植物提供了可能，上述移植物回輸有助于降低移植后急性移植物抗宿主病的發生率[14]。

總之，本研究以健康女性供者為研究對象，從年齡、BMI、外周血LYM等供者特征角度提供了影響骨髓和外周血混合移植物中造血細胞和免疫細胞含量的詳細參數，有助于女性最佳供者的選擇[15]。鑒于本研究為回顧性、單中心研究，今后應該開展多中心、前瞻性研究來證實上述結果。