光和溫度對兩種綠潮藻光合途徑及抗氧化功能的影響

馬茜，王玉玨，孫西艷，劉東艷*

( 1. 華東師范大學 河口海岸學國家重點實驗室，上海 200241；2. 中國科學院牟平海岸帶環境綜合試驗站，山東 煙臺264003)

1 引言

綠潮是指潮間帶大型綠藻在特定環境條件下大量增殖，形成的高生物量生態災害[1-2]。該現象多發生在富營養化的潮間帶區域，以石莼屬（Ulva）物種為主，如：以腸滸苔（Ulva intestinalis）為原因種的綠潮在世界多個海域的潮間帶都有過報道[1-5]。個別綠潮物種能夠脫離固著基，進入海域漂浮生長，并形成大規模高生物量災害，給社會經濟造成巨大損失，如：我國黃海滸苔（Ulva prolifera）綠潮的暴發[6-7]。綠潮的暴發不僅受到溫度、營養鹽等多個環境因素的誘導，而且與自身的繁殖能力、生理生化功能密切相關，其中，高效的光合速率與營養鹽吸收能力往往是物種在短時間內大量增殖的重要生物學基礎[8-9]。

多數藻類植物的光合作用以卡爾文循環（C3）為主[10-11]，利用CO2合成有機碳。然而，Hatch-Slack 光合途徑（C4）或者類似C4途徑參與的藻類光合作用在20 世紀70 年代已有報道，例如，硅藻門中的三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和威氏海鏈藻（Thalassiosira weissflogii），以及褐藻門中的四疊團扇藻（Padina tetrastromatica），均可以利用，將其固定在C4雙羧酸中，經過一系列反應轉化成CO2進入C3途徑，形成固碳效應[12-14]。近年來的研究發現，在有些綠潮物種的光合固碳中，可能也存在C4或者類似C4途徑的參與過程，并成為提高其光合效率、快速增殖的重要生理生化機制[15]，如：黃海滸苔中就存在與C4途徑相關的基因以及光合產物[15-16]。一般來說，C4植物的光合效率能高于C3植物的50%[17]，其最大的日生長率是C3植物的2～8 倍[18-20]。因此，有必要對綠潮物種是否存在C4途徑以及在固碳中的重要性做進一步探討，這對于理解其生態災害暴發的生物學機制具有重要意義。

C3和C4植物對環境的適應能力不同，C3植物最適生長溫度一般為20～25℃，其飽和光強為全日照的一半，而C4植物最適生長溫度為30～35℃，其凈光合作用隨著光強的增加而增加，沒有飽和光強[21-22]。因此，高光強與溫度通常是誘導植物啟動C4循環機制的關鍵環境因子。藻類光合作用過程中產生大量的氧氣，在強光下發生光抑制時，碳同化能力的下降會改變細胞內的氧化還原環境，產生對細胞有害的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）[23]。若此反應過程與清除ROS 的酶系相偶聯，如：超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase, SOD）、過氧化物酶（Peroxidase,POD）、過氧化氫酶（Catalase, CAT）和抗壞血酸（Ascorbic Acid）等，則能清除細胞內多余的ROS[23]。這些酶相互之間起到協同作用，其中SOD 是抗氧化系統中最重要的酶類，因其催化超氧自由基形成過氧化氫（H2O2），由此啟動下游反應，H2O2又繼續被POD 和CAT 清除。因此，C4植物相對于C3植物能更好地應對氧化脅迫，具體表現在抗氧化酶（SOD、CAT 等）活性增加以及非酶抗氧化劑（抗壞血酸）的增加[24]。

基于上述研究基礎，本研究選取煙臺潮間帶的兩個綠潮原因物種腸滸苔和Ulva expansa作為研究對象。其中，U. expansa的夏季綠潮在美國加利福尼亞州的蒙特利（Monterey）海灣多次被報道[5,25]，在我國煙臺牟平海域連續5 年暴發小規模綠潮，對當地海域環境造成一定的影響，具有研究的必要性。本研究利用夏季高溫、高光強條件，通過室外培養實驗比較了腸滸苔和U. expansa的C3關鍵酶（二磷酸核酮糖羧化酶，Ribulose Bisphosphate Carboxylase Oxygenase, Rubsico）和C4關鍵酶（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，Phosphoenolpyruvate Carboxylase, PEPCase；磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，Phosphoenolpyruvate Carboxykinase, PEPCKase）的活性變化特征，分析了它們與光強、溫度的響應關系，同時測定了主要的抗氧化酶（SOD、POD）及其 產 物 丙 二 醛（ Malondialdehyde, MDA） 的 變 化，MDA 是生物體自由基發生過氧化反應的終產物，可以作為脂膜過氧化程度以及植物的抗逆性的指標，進一步解答兩種綠藻的抗氧化能力。實驗還分析了藻體對應光合產物δ13C 的變化，探討了C4途徑在兩個物種光合固碳中發生作用的可能性。

2 材料與方法

2.1 樣品采集與預處理

于2018 年7 月在山東省煙臺市牟平區潮間帶（37.46°N, 121.71°E）采集腸滸苔和U. expansa樣品，裝于冰盒帶回實驗室。挑選出健康藻體，用消毒海水清洗，除去泥沙和其他雜物后，將樣品置于40 L 透明塑料箱內，加入經GF/F 膜過濾的自然海水。將培養箱置于室外通風處，每隔1 天換1 次過濾海水，預培養1 周。

2.2 室外培養實驗

室外培養實驗于2018 年7 月26-29 日期間，在中國科學院煙臺海岸帶研究所牟平野外臺站開展。兩種綠藻分別培養，各用3 個培養箱作為平行樣，每個培養箱放入40 g（濕重）綠藻樣品，加入40 L 過濾海水，再將培養箱放置于室外海水池（60 m×100 m）中（圖 1）。培養海水的初始溶解無機氮和磷酸鹽濃度分別為34.6 μmol/L 和0.67 μmol/L。培養 時間從8 時開始 到18 時結束，每隔2 h 進行一次取樣，每個培養箱每次取樣1.2 g（濕重）。樣品保存到?80℃超低溫冰箱，用于測定酶活和組織δ13C。現場測定日光照強度（TES-1339R, TES）、培養海水溫度（PT3003, Anymeter）以及培養海水鹽度（S3-Standard kit, Mettler-Toledo）的變化情況。

圖 1 室外培養實驗場景Fig. 1 The outdoor culture experiment

2.3 酶活的測定

每種酶活測定需0.1 g（濕重）冷凍藻體，稱取好的樣品在液氮中研磨后進行測定。其中，Rubsico、PEPCase 活性測定分別采用Solarbio 公司的二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Rubisco）試劑盒、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）試劑盒；PEPCKase 的活性測定采用南京建成生物工程研究所的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶試劑盒。3 種酶的活力單位均定義為在25℃條件下，每克新鮮組織每分鐘消耗1 nmol 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide, NADH）所需的酶量（單位：nmol/（min·g））。

SOD、POD 活性和MDA 含量的測定分別采用南京建成超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、過氧化物酶（POD）測試盒以及植物丙二醛（MDA）測試盒。SOD的活力單位定義為37℃條件下，在本反應體系中SOD 抑制率達50%時所對應的酶量（單位：U/g）；POD 的活力單位定義37℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘轉化1 μg 底物所需的酶量（單位：U/mg（Protein））。

2.4 藻體組織δ13C 的測定

用0.1 mol/L 鹽酸沖洗藻體后，再用Milli-Q 水將酸清洗干凈。清洗后的樣品冷凍干燥48 h，進行研磨。取0.5～1 mg 研磨樣品用4 mm×6 mm 錫箔包樣后，以美國南卡羅來納的石灰巖制品（PDB）的同位素比值為標準，在中國科學院煙臺海岸帶研究所的穩定同位素質譜儀（MAT 253, Thermo Scientific）上測定藻體δ13C 值。實驗室重復測定的分析誤差小于0.2‰。

利用端元模型計算了藻體對CO2和的相對利用率[26]。若藻類單獨利用CO2，所得的藻體組織δ13C 最大值為?30‰，若藻類單獨利用，所得的藻體組織δ13C 最小值為?10‰[27]；因此，在公式中純利用CO2的端元值設定為?30‰，純利用的端元值設定為?10‰，藻類利用合成光合產物的貢獻率（ fHCO?3）表達式為

2.5 數據處理與分析

運用SPSS 22 對實驗數據進行單因素方差分析（One-way ANOVA）、t檢驗（t-test）以及Pearson 相關性分析，顯著性水平設為p＜0.05。數據先采用Shapiro-Wilktest 進行正態性檢驗，再用Levene 檢驗進行方差齊性檢驗；若存在方差不齊的情況，采用Welch 檢驗。所得數據以平均值±標準偏差表示。

圖 2 兩種綠藻C3 關鍵酶（Rubisco）與C4 關鍵酶（PEPCase、PEPCKase）活性的日變化特征比較Fig. 2 The comparison of diurnal variations of C3 key enzyme(Rubisco) and C4 key enzyme (PEPCase and PEPCKase) activities between U. intestinalis and U. expansa

3 結果

3.1 C3 與C4 關鍵酶的日變化特征

實驗過程中，海水溫度變化范圍為27.4～32.6℃，光照強度的變化范圍為57.5～1 857.6 μmol/（m2·s），最高值均出現在12:00（圖 2）。海水鹽度的變化范圍較?。?1.2～32.1），受水分蒸發的影響，最高值出現在實驗結束時。

C3關鍵酶Rubisco 活性的日變化在腸滸苔與U.expansa中存在顯著差異（圖 2A）：腸滸苔的Rubisco 活性在10:00 和16:00 分別出現了高峰值（27.7 nmol/（min·g）和25.4 nmol/（min·g）），活性峰值（10:00）相比初始時間（8:00）增加53.0%，但在中午（12:00-14:00）顯著下降（圖 2A）。U. expansa的Rubisco 活性高峰值出在12:00（61.5 nmol/（min·g）），高光、高溫條件（12:00）并沒有抑制U. expansa的Rubisco 活性（圖 2A）；根據相關性分析，U. expansa的Rubisco 活性與環境因素（溫度、光強）呈正相關關系，與溫度的相關性極顯著（p＜0.01），而腸滸苔沒有表現出顯著相關（表 1）。C4關鍵酶PEPCase 和PEPCKase 活性在腸滸苔中的顯著峰值出現在12:00，分別為68.4 nmol/（min·g）和334.9 nmol/（min·g），比初始時間（8:00）分別增加了82.8%和199.9%，與光強變化一致（圖 2B，圖 2C）；根據相關性分析，PEPCKase 活性與溫度、光強呈顯著正相關關系（p＜0.05）（表 1）。比較而言，C4關鍵酶PEPCase 和PEPCKase 活性在U. expansa中的變化不顯著（圖 2B，圖 2C），而且PEPCKase 活性與溫度、光強呈顯著負相關關系（p＜0.05）（表 1），說明高光、高溫（12:00）沒有能夠誘導U. expansaC4光合作用途徑的高表達。

3.2 兩種綠藻光合產物的δ13C 變化特征

已有文獻資料表明，C3和C4植物的δ13C 數值范圍分別為?35‰～?22‰與?17‰～?11‰之間[28]，這是因為Rubisco 同化CO2，而PEPCase 同化，即兩種途徑優先利用的碳源不同，故導致光合產物δ13C 值存在差異[29-30]。培養期間，腸滸苔的組織δ13C 變化范圍為?17.1‰～?15.7‰， fHCO?3的變化范圍為64.5%～71.3%（圖 3），這表明其同化的比例較高。此外，腸滸苔組織δ13C 在14:00 出現明顯偏正的現象，盡管略滯后于C4關鍵酶PEPCase 和PEPCKase 活性的最高值（圖 2B，圖 2C），但基本能夠指示酶活與產物的對應關系，說明存在C3與C4途徑混合的特征。比較而 言，U. expansa的δ13C 范 圍 為?23.5‰～?21.9‰，的變化范圍為32.4%～40.3%（圖 3），表明該物種以C3途徑為主，這與酶活測定的結果相對應（圖 2B，圖 2C）。

圖 3 兩種綠藻組織δ13C 和 fHCO?3的日變化特征Fig. 3 The diurnal variations of δ13C and fHCO?3 in the tissue of U. intestinalis and U. expansa

3.3 兩種綠藻抗氧化能力的比較

實驗過程中，腸滸苔表現出了較強的抗氧化能力，SOD 活性一直保持一個較高的水平，18:00 活性下降（圖 4A）；POD 活性的峰值出現在早上8:00?10:00（圖 4B）；MDA 含量的峰值出現在12:00（圖 4C）。相關性分析表明，腸滸苔的SOD 活性和MDA 含量與溫度、光強呈顯著正相關（p＜0.05），POD 活性與溫度、光強的相關性則不顯著（p＞0.05）（表 2）。U. expansa的SOD 與POD 活性峰值出現在12:00?14:00；MDA含量的峰值出現在12:00（圖 4）；相關性分析表明，U.expansa的SOD、POD 活性以及MDA 含量與溫度、光強的相關性不顯著（p＞0.05）（表 2）。

比較而言，腸滸苔SOD 的活性在低光、低溫（18:00）條件下比高光、高溫（12:00）條件下降了33.3%；而U.expansa的SOD 的活性在低光、低溫（18:00）條件下比高光、高溫（12:00）條件下降了27.6%。腸滸苔MDA的含量在低光、低溫（18:00）條件下比高光、高溫（12:00）條件下降了36.9%；而U. expansa的MDA 的含量在低光、低溫（18:00）條件下比高光、高溫（12:00）條件下降了10.6%。

4 討論

大多數海洋藻類植物的光合作用途徑以C3循環為主，Rubisco 是C3途徑中的重要羧化酶，固定CO2并形成碳水化合物[21]。然而，Rubisco 只能利用CO2形式的無機碳，但海水中溶解態CO2濃度較低，不能完全滿足其合成需求，因此，藻類植物在進化中形成了二氧化碳濃縮機制（CO2Concentrating Mechanisms,CCMs），促進細胞內CO2濃度的積累。CCMs 能夠在Rubisco 周圍催化脫羥基釋放CO2，完成相應的濃縮反應[31-32]。C4循環則可以直接利用，通過PEPCase、PEPCKase 等酶的催化作用，在細胞內完成對CO2的收集、濃縮和轉運等系列過程[14,33-35]。海洋藻類C4循環功能的機制與重要性目前仍存在科學爭議，例如，有研究認為C4循環途徑在藻類植物的固碳中扮演重要角色[35]，但也有研究表明C4循環的主要功能是參與能量代謝，驅散細胞內多余的光能，對固碳作用的貢獻不大[36]。本研究中發現腸滸苔與U. expansa的光合途徑存在顯著差異，前者的光合固碳可能由C3和C4途徑共同參與，而后者則主要通過C3途徑進行。藻類植物的光合途徑變化受到多種環境因子的誘導，如溫度、光強、CO2濃度、營養鹽、鹽度等[12,15,37-38]。多數研究表明，C4循環過程中需要合成相應的酶蛋白，是一個高耗能過程，因此，充足的營養鹽濃度、溫度與光強是誘發C4途徑活躍的重要環境條件[12,39]，本研究的藻類培養液中設置了較高的營養鹽濃度，充分保證了C4途徑的物質合成需求。由于C4途徑沒有飽和光強限制，故其凈光合作用隨著光強的增加而增加，在白天最高光強時的光合潛力最大。研究表明，90%的碳同化率的變動是由光強變化導致的[40-42]，晴天中午的高光條件往往是激發酶活力變化的主導因素。在本研究中，C4關鍵酶PEPCase 和PEPCKase 活性在腸滸苔中的峰值出現在中午（圖 2B，圖 2C），對應了最高光強，且同時形成了偏正的δ13C 值（?17.1‰～?15.7‰）與高的 fHCO?值（64.5%～71.3%），指示了C4循環極可能參與了該物種的光合固碳。相比之下，C3光合作用途徑的重要羧化酶Rubisco 的活性容易受到強光照（1 200～1 500 μmol/（m2·s））的抑制作用[43-44]，在培養過程中，腸滸苔的Rubisco 活性在中午（12:00?14:00）強光照條件下（大于1 600 μmol/（m2·s））明顯受到抑制。因此，推測C4循環參與補充了該物種的光合固碳能力。

圖 4 兩種綠藻抗氧化物酶（SOD、POD）活性和MDA 含量的日變化特征比較Fig. 4 The comparison of antioxidant enzymes (SOD, POD)actirities and MDA content between U. intestinalis and U. expansa, corresponding to diurnal variations

表 2 兩種綠藻的抗氧化酶（SOD，POD）活性以及MDA 含量與溫度、光強的相關性Table 2 Correlation between antioxidase activities, MDA content of U. intestinalis and U. expansa vs. temperature and light intensity

比較而言，U. expansa在培養過程中表現出的光合作用特征與腸滸苔存在顯著差異。該物種遵循了大多數海洋藻類的光合特征，其δ13C 范圍（?23.5‰～?20.9‰）與的比例（32.4%～40.3%）均表明該物種是以C3途徑為主要固碳方式（圖 3）。C4關鍵酶PEPCase 和PEPCKase 活性的變化在培養過程中不顯著，且Rubisco 活性高峰值出在中午最高光強，沒有出現光抑制現象，可能由于上午U. expansa的Rubisco 活性較高，光合能力較強，釋放出大量的O2，使得中午的藻體處于高O2分壓低CO2的狀態，則促進Rubisco的加氧反應，即光呼吸過程[45]。這些特征也表現在兩個物種的抗氧化能力上。光合作用的不同導致放氧量不同，細胞內部積累大量的ROS，使得抗氧化和氧化的平衡狀態被破壞，而SOD、POD 等多種抗氧化酶不僅能清除多余的ROS 來維持胞內的代謝平衡，還能維持一定的光合電子流，來減緩多余光能對光合系統造成的損害[23,46]。本研究的結果表明，在相同條件下，腸滸苔SOD 的活性明顯高于U. expansa，活性變化沒有U. expansa劇烈，所以受到的脅迫損傷也相應較小；作為脂膜過氧化程度的指示物，U. expansa的MDA 含量均高于腸滸苔。由此推測，高溫、高光強對U. expansa的影響高于腸滸苔，部分原因是抗氧化能力不如腸滸苔。實驗后期U. expansa的POD 活性略高于腸滸苔，可能是其本身反應相對滯后或者與其他抗氧化酶起協同作用。有研究表明，C4光合作用酶（特別是PEPCase）的基因高表達能誘導SOD 和POD 的活性增強，并且隨著光抑制（強光）的加劇，SOD 和POD 的活性也逐步增強，ROS 產生速率較低，MDA 積累較少，維持較穩定的光合能力，從而表現出較強的耐光抑制能力[47-49]。由此推測，腸滸苔較強的抗氧化能力可能與PEPCase 的高表達有關。

此外，有研究發現較高的溫度有助于誘導植物形成類似C4循環的光合途徑，處于高溫環境下的時間越長，C4途徑的PEPCase 的活性越大[50-51]。例如，C3途徑在15～30℃范圍內，凈光合速率與溫度正相關；而C4途徑在30～40℃范圍內的凈光合速率與溫度正相關，且大于C3途徑的凈光合速率[52-53]。這些研究結果有助于解釋綠潮物種的季節演替現象，例如，1997 年夏季美國加利福尼亞州的紐波特河口暴發的綠潮主要組成物種是腸滸苔和U. expansa，到了秋季，隨著溫度降低，逐漸演變成U. expansa和Ceramiumsp.[5]；煙臺牟平海域U. expansa通常是在7 月暴發，7 月底至8 月初，隨著海水溫度升高而迅速消亡。U.expansa的演替與消亡現象，表明該物種暴發的溫度上限低于腸滸苔，與本研究的實驗結果相吻合。

5 結論

通過對腸滸苔和U. expansa的光合作用酶及其藻體光合產物的關聯性分析，發現腸滸苔與U. expansa的光合途徑存在顯著種間差異性。在高溫、高光條件下，C4關鍵酶活性在腸滸苔中表達活躍，與光合產物形成對應關系指示了其光合作用可能由C3與C4途徑共同參與；而U. expansa的C4關鍵酶活性表達不活躍，與光合產物形成對應關系指示了其光合作用主要依靠C3途徑進行。然而，C4循環在藻類植物中的功能表達存在不確定性，未來還需要探索進一步其他環境因素的誘導作用以及藻類的基因表達特征。

致謝：感謝華東師范大學孫賽賽、周鵬、周豪對樣品采集和培養實驗的幫助，以及煙臺海岸帶研究所譚揚對碳同位素測定的幫助。