脈沖電磁場抗骨質(zhì)疏松作用及對Smurf1表達的影響

孫智路 尹劍 黃開亮 譚位華 劉靜

1.南華大學附屬第一醫(yī)院急診部，湖南 衡陽 421001

2.南華大學附屬第一醫(yī)院康復醫(yī)學科，湖南 衡陽 421001

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是由多種原因導致的骨密度和骨質(zhì)量下降，可引發(fā)全身性骨折[1]。目前臨床治療OP仍以藥物緩解癥狀為主，雌激素及其受體調(diào)節(jié)劑、雙膦酸鹽、降鈣素等藥物對OP患者的骨丟失癥狀有一定抑制作用，但大多療程長，有較多副作用[2-3]。近來多項研究[2,4]表明，脈沖電磁場(pulsed electromagnetic field，PEMF)可有效治療OP，刺激骨形成，提高骨密度，改善骨強度，且該治療方法為生物物理手段，副作用小，然而其具體作用機制尚不完全明確。泛素-連接酶E3中Smad泛素化調(diào)節(jié)因子1(Smad ubiquitin regulator 1，Smurf 1)是泛素連接酶Hect家族新成員，可獨立誘導Smad1、Smad5泛素化及降解，與OP發(fā)生發(fā)展及骨代謝異常密切相關[5-9]。基于此，本研究以去卵巢骨質(zhì)疏松(ovariectomy osteoporosis，OVX-OP)大鼠為模型，探究PEMF對OVX-OP大鼠的治療作用及對Smurf1蛋白表達的影響，以期揭示其可能作用機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物:選取6月齡SPF級未孕雌性SD大鼠43只(貨號：J001)，體重(300±10)g，購自南京君科生物工程有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫(24±2)℃、濕度(50±10)%，12 h/12 h光照/黑暗，自由飲水飲食環(huán)境下適應性飼養(yǎng)1周。本研究經(jīng)本院動物實驗倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑及儀器：苯甲酸雌二醇注射液(批準文號：國藥準字H44023822)購自廣州白云山明興制藥有限公司；戊巴比妥鈉(批準文號：國藥準字H31021724)購自上海上藥新亞藥業(yè)有限公司；鹽酸四環(huán)素熒光染料(貨號：0422-100G)購自浙江聯(lián)碩生物科技有限公司，鈣黃綠素熒光染料(貨號：FS1162)購自上海復申生物科技有限公司；蛋白抽提試劑盒(貨號：P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(貨號：P0010S)均購自上海碧云天有限公司；一抗鼠源anti-Smurf1抗體(貨號：ab57573)、兔源anti-β-actin(貨號：ab8227)、二抗羊抗兔IgG(貨號：ab6721)、羊抗鼠IgG(貨號：ab205719)抗體購自英國Abcam公司；FC酶標儀購自美國Thermo Fisher公司；雙能X射線實驗動物骨密度測定儀(型號：InAlyzer，韓國)購自佰泰科技有限公司；Union2000型PEMF骨質(zhì)疏松治療儀(大鼠型)、半自動圖像數(shù)字化分析儀購自日本尼康公司等。

1.2 方法

1.2.1模型建立：將43只大鼠用2 %戊巴比妥鈉(0.2 mL/100 g)經(jīng)腹腔注射麻醉后，在嚴格無菌條件下取腰背椎后側正中切口，鈍性分離肌肉組織，摘除33只大鼠兩側卵巢組織，逐層縫合創(chuàng)口，術后青霉素連續(xù)注射3 d。其中麻醉致死1只，術后創(chuàng)口感染致死2只，共存活30只，術后6 d將大鼠隨機分為模型組(M組)、雌激素治療組(E組)和PEMF組，每組10只。另10只大鼠只切除卵巢周圍與卵巢大小相仿的脂肪組織，為假手術組(S組)。術后各組大鼠分籠飼養(yǎng)，在室溫(24±2)℃、濕度(50±10)%、定期紫外線消毒和通風、12 h間隔照明條件下，自由攝取標準飼料和消毒的蒸餾水。術后8周除假手術組外的其他各組大鼠右肱骨骨密度顯著降低，提示骨質(zhì)疏松動物模型造模成功。E組于術后9周采用苯甲酸雌二醇注射液(0.2 mg/kg)進行皮下注射，每兩周1次；PEMF組于術后9周采用Union 2000型PEMF骨質(zhì)疏松治療儀(大鼠型)進行治療，設置參數(shù)：8 Hz，自動跳轉周期為30 s，最大感應磁場強度3.82 mT，每次40 min，1次/d；S組、M組常規(guī)飼養(yǎng)，不予以任何處理。治療8周后，進行相關數(shù)據(jù)采集及檢測。

1.2.2一般狀態(tài)觀察：治療期間觀察各組大鼠生存狀態(tài)、飲食情況等，稱取治療前后各組大鼠體重。

1.2.3右肱骨骨密度檢測：治療結束后，采用2%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)對各組大鼠行腹腔注射麻醉后置于雙能X射線實驗動物骨密度測定儀平臺上，測定其右肱骨骨密度。

1.2.4骨形態(tài)計量學檢測：大鼠處死前第13、14天分別于皮下注射四環(huán)素(25 mg/kg)作為第一次熒光標記，注射后第3、4天分別于皮下注射鈣黃綠素(5 mg/kg)作為第二次熒光標記。治療結束后，采用2%戊巴比妥(0.2 mL/100 g)對各組大鼠行腹腔注射麻醉處死，取右前肢，剔除肌肉及軟組織，取適量骨膜于液氮中凍存?zhèn)溆谩Ａ砝^續(xù)完整取出脛骨，沿縱面鋸開，進行不脫鈣骨包埋。采用半自動圖像數(shù)字化分析儀對脛骨上1/3作靜態(tài)檢測。靜態(tài)參數(shù)包括：骨體積分數(shù)(trabecular bone volume ratio,BV/TV)、骨小梁數(shù)(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)和骨小梁分離度(trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.5骨組織Smurf 1蛋白表達量檢測:采用免疫印跡(western blot，WB)檢測各組大鼠骨組織Smurf 1蛋白表達量。嚴格按照蛋白提取試劑盒說明提取收集的各組大鼠骨膜組織總蛋白，并采用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品進行6 % SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，添加anti-Smurf1(稀釋比1∶500)、anti-β-actin(稀釋比1∶500)抗體4 ℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜，添加二抗IgG(稀釋比1∶5 000)室溫孵育1 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察結果并拍照分析各蛋白條帶灰度值，分別以靶蛋白Smurf 1灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值比值為Smurf 1蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 各組大鼠一般情況比較

與S組比較，M組、E組、PEMF組大鼠精神狀況欠佳，飲食、活動及大小便未見異常。治療前，與S組比較，M組、E組、PEMF組大鼠體重均明顯增加(P<0.05)。治療后，E組、PEMF組大鼠體重較治療前均顯著降低(P<0.05)；與S組比較，M組大鼠體重顯著增加(P<0.05)；與M組比較，E組、PEMF組大鼠體重顯著降低(P<0.05)；E組與PEMF組比較，大鼠體重差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠治療前后體重比較Table 1 Comparison of weight of rats in each group before and after treatment (g,

2.2 各組大鼠骨密度值比較

治療前，與S組比較，M組、E組、PEMF組大鼠骨密度值顯著降低(P<0.05)；治療后，E組、PEMF組大鼠骨密度值較治療前顯著升高(P<0.05)；與S組比較，M組大鼠骨密度值顯著降低(P<0.05)；與M組比較，E組、PEMF組大鼠骨密度值顯著增加(P<0.05)；E組與PEMF組比較，大鼠骨密度值差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠治療前后骨密度值比較Table 2 Comparison of bone mineral density of rats in each group before and after treatment

2.3 各組大鼠形態(tài)計量學結果比較

與S組比較，M組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著降低(P<0.05)，Tb.Sp顯著增加(P<0.05)；與M組比較，E組、PEMF組大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高(P<0.05)，Tb.Sp顯著降低(P<0.05)；E組與PEMF組比較，大鼠BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠形態(tài)計量學結果比較Table 3 Comparison of morphometric results of rats in each group

2.4 各組大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量比較

與S組比較，M組大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與M組比較，E組、PEMF組大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量顯著降低(P<0.05)；E組與PEMF組比較，大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見圖1、表4。

圖1 WB檢測大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量Fig.1 WB detection of Smurf1 protein expression in rat bone

表4 各組大鼠治療后骨組織Smurf1蛋白表達量比較Table 4 Comparison of Smurf1 protein expression in bone tissue of rats in each group after treatment

3 討論

本研究采用大鼠OVX-OP模擬原發(fā)性OP，摘除卵巢后，大鼠體內(nèi)雌激素顯著降低，可引起破骨細胞凋亡減少，成骨細胞凋亡增加，發(fā)生OP[11]。目前國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，PEMF對促進骨形成、抑制骨吸收、改善骨密度具有重要作用，可有效治療OP。Lei等[13]研究報道，PEMF可提高OVX-OP小鼠椎體骨量，增強其骨結構及骨強度，與OVX組比較，OVX+PEMF組骨形成標志物骨特異性堿性磷酸酶(bone isoenzyme alkaline phosphatase，BALP)、血清骨鈣素(osteocalcin，OCN)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、I型前膠原n端前肽(N-terminal propeptide of type I procollagen，P1NP)明顯升高，腰椎小梁骨質(zhì)量下降和小梁骨顯微結構的惡化減輕，可能與Wnt3a/LRP5/β-catenin和OPG/RANKL/RANK信號通路骨骼基因表達有關。劉西紡等[2]研究報道，極低頻脈沖電磁場結合全身振動治療可提高廢用性OP大鼠骨密度，改善骨小梁微結構，提高骨生物力學性能，兩者有協(xié)同作用，治療效果優(yōu)于單一治療。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與S組比較，M組大鼠骨密度值、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著降低，Tb.Sp顯著增加；與M組比較，E組、PEMF組大鼠骨密度、BV/TV、Tb.N、Tb.Th顯著升高，Tb.Sp顯著降低，與文獻報道一致；E組與PEMF組比較，各指標差異無統(tǒng)計學意義，BV/TV可反映骨量變化，Tb.Sp可反映骨小梁的顯微結構，提示PEMF可增加骨密度、改善骨形態(tài)，與雌激素的作用相似，對OP具有一定治療作用，提示PEMF在OP的治療中可能有雌激素樣作用。

泛素-蛋白水解酶復合體通路(ubiquitin-proteolytic pathway，UPP)是一種特異性降解胞內(nèi)調(diào)控蛋白的主要途徑，具有ATP依賴性，主要由泛素、泛素連接酶和26S蛋白水解酶復合體組成[14]。Smurf1是一種泛素連接酶，具有HECT結構域，屬于泛素連接酶Hect家族新成員，在骨形成、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生的調(diào)控中發(fā)揮重要作用[15]。Smurf1還可優(yōu)先與Smad1、5接頭區(qū)域的PPXY結構域結合，誘導其泛素化和降解，而Smad可通過介導轉化生長因子-β(transforming growth factor-beta，TGF-β)或骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)參與骨形成和骨吸收等骨代謝調(diào)節(jié)[16-20]。Liang等[21]研究報道，抑制成骨細胞中Smurf1表達可促進年齡相關性骨質(zhì)疏松小鼠模型的骨形成。尚德陽等[22]研究報道，與正常組、假手術組比較，OVX-OP大鼠骨、腎組織中Smurf1/Smurf2 mRNA表達明顯降低，下丘腦中表達升高，補腎中藥可改善Smurf1/Smurf2 mRNA表達，防治骨質(zhì)疏松。本研究結果發(fā)現(xiàn)，與S組比較，M組大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量顯著升高；與M組比較，E組、PEMF組大鼠骨組織Smurf1蛋白表達量顯著降低，與尚德陽等文獻報道[22]不完全一致，與Liang、Zhang等文獻報道一致[21,23]。Smurf1蛋白調(diào)控骨形成可能存在不同機制，綜合文獻報道及本研究結果，提示骨組織Smurf1蛋白表達量升高可能與骨質(zhì)疏松癥有關。PEMF可促進骨形成、增加骨密度，防治骨質(zhì)疏松，可能與骨組織Smurf1蛋白表達下調(diào)有關，但有待進一步驗證。

綜上所述，PEMF可增強骨形成，提高OP大鼠骨密度，改善其骨丟失癥狀，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用，可能與Smurf1蛋白下調(diào)表達有關，為臨床OP的治療提供了新的思路。但本研究只是進行了初步探討，關于Smurf1蛋白下游信號的分子機制尚不明確，還有待進一步深入探究及驗證。