OSMAC 方法在微生物次級代謝產物研究中的應用

朱美林 王皓天

（蚌埠醫學院，安徽 蚌埠233000）

1 概述

微生物次生代謝物已被認為是藥物發現和開發中新化合物的主要來源。傳統的微生物化學研究主要集中在從發酵液和菌絲體中提取和分離具有結構活性的化合物。然而，由于已知次生代謝物的高重新發現率，這些過程正變得低效[1]。人們普遍認為，在標準發酵條件下，很大一部分微生物基因簇是沉默的。通過挖掘微生物基因組和針對次生代謝物的生物合成基因簇，研究人員可以更客觀地挖掘微生物的潛力，如擊倒、引入或異源表達微生物基因，調節啟動子，誘導突變，或改變培養條件來刺激次生代謝物基因的表達[2]，見圖1。改變培養條件被認為是最簡單、最有效的策略，被Zeeck 教授和他的同事稱為"一株多化合物(OSMAC)"[3]。在廣泛查閱文獻的基礎上，本文總結了應用OSMAC 策略的重要和成功的例子，包括改變培養基、改變培養條件、與其他菌株共培養、添加表觀遺傳修飾劑或生物合成前體[4]。

圖1 激活微生物沉默基因簇的策略

2 OSMAC 常見方法

2.1 改變培養基成分及培養方式

培養基不僅對微生物生長有較大影響，而且對新陳代謝也有較大影響。據報道，C/N 比、鹽度和金屬離子可以調節MSM基因表達的程度和模式，導致各種次生代謝產物的產生。

一株海洋來源的Asteromyces cruciatus 763 菌株在僅含精氨酸的查氏培養基中培養時，產生了一種新的五肽lajollamide A（1），見圖2，而不是在正常的查氏培養基中缺失的NaNO3[5]。

圖2 部分代表化合物的結構式

一株曲霉屬真菌Aspergillus sp.在富氘查氏肉湯上培養時，從中分離得到了6 個生物堿類化合物，而該菌株在PDB 培養基中培養時，能代謝一種新的戊烯化吲哚生物堿waikialoid A（2），該生物堿對白色念珠菌生物膜的形成有較強的抑制作用，IC50值為1.4μM[6]。

在燕麥麩皮培養基中，一株鏈霉菌Streptomyces sp. A1 在甘露醇/豆粕培養基中合成了3 個已知化合物，在添加土壤的培養基(脫脂豆粕2%、甘露醇2%、瓊脂2%)中合成了3 個新的同系物和streptenol E（3）。Streptenol E 對HMO2、HepG2、MCF-7和Kato III 四種腫瘤細胞株有明顯的細胞抑制作用，GI50值分別為0.15、0.3、10 和0.7 μM[7]。

與海水培養相比，一株海洋來源的真菌Aspergillus unguis CRI282-03 CRI282-03 在KBr 培養基中產生了新的depsidones和兩種新的depsidones 衍生物（4, 5），在KI 發酵液中產生了一種新的地西酮（6）[8]。

同時，越來越多的證據表明，培養狀態可以直接影響微生物的代謝過程，包括固體或液體，靜態或動態。雜色曲霉A.versicolor ZLN-60 菌株在靜態液體條件下能產生2 個新的環五肽和4 個新的戊烯基二苯醚。生物學試驗表明，化合物（7）對Hela 和K562 癌細胞具有中等的細胞毒作用，IC50值分別為31.5和48.9μM。然而，對其固體培養基粗提物的進一步純化，還檢測到了另外4 個新的環肽[9，10]。一株海洋來源的鏈霉菌Streptomyces sp. CHQ-64 菌株在液體培養基中振蕩培養產生6個新的抗真菌多元醇和2 個細胞毒性的雜合異戊二烯生物堿，而該菌株在靜態條件下只產生1 個新的雜合異戊二烯生物堿（8）[11]。

2.2 添加前體

生物合成前體是指一種易于直接結合到最終產品中的化學物質。在發酵培養基中添加各種生物合成前體可以改變次生代謝物的生物合成途徑，從而產生新的化合物。用阿魏酸+奎寧酸或肉桂酸+3，4-(亞甲基二氧基)肉桂酸處理來自咖啡成熟漿果的內生菌殼青霉，產生霉酚酸和5- 羥基7- 甲氧基-4- 甲基苯酞（9）。在L- 色氨酸和D- 色氨酸供應的培養基中，從一株海洋來源的印度毛殼菌KLA03 中鑒定了3 個新的細胞松弛素。化合物（9）對A549 細胞有較強的細胞毒作用，IC50值為8.2 μM[12]。

2.3 添加酶抑制劑

表觀遺傳修飾劑是指那些能夠隨著表觀遺傳狀態的改變而改變微生物特性的化學物質，如DNA 甲基轉移酶(DNMT)抑制劑和組蛋白脫乙酰化酶(HDAC)抑制劑。這些修飾劑的加入通常會抑制生物合成途徑中相關酶的活性，促進其他代謝途徑的進展。

5- 氮胞苷(5-AC)是一種最常用的DNMT 抑制劑，用于修飾微生物DNA 的功能，其次是抑制基因轉錄。對一株海洋來源的真菌Aspergillus sydowii 進行化學研究，在其培養基中添加5-AC 時，得到了新的雙拋物烷型倍半萜類化合物（10）[13]。

組蛋白的乙酰化或去乙酰化影響其與微生物中DNA 的結合。雙羥肟酸(SBHA)、異羥肟酸(SAHA)和煙酰胺是最常用的HDAC 化學物質，用于抑制微生物中的脫乙酰基，促進基因轉錄和表達。

許多報道表明，培養基中SAHA 的存在可能導致新的天然化合物的產生，例如在SBHA 處理的培養基中，印度毛殼菌能產生2 個新的螺內酯聚酮和6 個新的戊烯基芳香族聚酮[14]。

2.4 混合培養

在一種培養基中，一種菌株與另一種菌株之間的關系可以是競爭的、拮抗的或友好的。兩個或兩個以上菌株的共培養通常有提高已知化合物產量或積累在無菌培養中未檢測到的隱蔽化合物的積極作用。從喀麥隆植物中發現的內生毛殼菌(Chaetomium sp.)，與銅綠假單胞菌共培養時能產生兩個新的莽草酸類似物和四個新的丁烯內酯衍生物，而這些化學物質在無菌培養基中都不存在[15]。

在采集自巴哈馬的海鞘的內生真菌Libertella sp. CNL-523與另一株Thalassospira sp. CNJ-328 混合培養產生了4 個新的二萜類化合物。化合物（11）對HCT-116 人腺癌細胞有明顯的細胞毒作用，IC50值為0.76 μM[16]。

3 結論

微生物對培養基成分、溫度、pH、鹽度、培養狀態、無菌或混合培養、表觀遺傳修飾劑、生物合成前體等培養條件敏感。這些因素的變化可能會改變次生代謝物的化學多樣性。傳統的微生物培養方法僅限于表達大量代謝途徑，許多次級代謝產物無法生物合成。越來越多的證據表明，OSMAC 策略可以為提高次級代謝產物的化學多樣性提供一種簡單、快速和有效的途徑，通過激活沉默的基因簇來獲得新的藥物先導。如今，新次級代謝產物的發現率越來越低，而重新發現已知化合物的可能性比以前更高。因此，OSMAC 戰略將是緩解這一挑戰的重要替代途徑。