電鏡下黃連素液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株的抑制作用及超微結(jié)構(gòu)的影響

胡致愷 葉姝 葉靜靜 陳寧剛

摘要：目的：通過(guò)黃連素液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進(jìn)行的體外抑菌試驗(yàn)，觀察黃連素液的抑菌效果，并以電鏡觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的改變。方法：用醫(yī)院自制的黃連素液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進(jìn)行處理后，用電鏡觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果：電鏡下，經(jīng)黃連素液處理的耐藥菌株菌體分散，部分菌體固縮死亡，而陰性對(duì)照組表現(xiàn)為細(xì)菌菌體聚集成團(tuán)，表面光滑，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、胞質(zhì)均勻，可見(jiàn)有絲分裂。結(jié)論：黃連素液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株有較強(qiáng)的抑菌效果。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌;黃連素;透射電鏡

本研究用黃連素液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株進(jìn)行體外試驗(yàn)，并采取電鏡來(lái)進(jìn)一步監(jiān)測(cè)細(xì)菌自身超微特征的變化情況，來(lái)觀察黃連素液的抑菌效果，現(xiàn)報(bào)道如下：

1材料與方法

1.1 材料

1.1.1 黃連素液

5%黃連素液為醫(yī)院長(zhǎng)期臨床使用的院內(nèi)制劑，250 ?g黃連中藥藥材粉碎加水浸泡2 h，強(qiáng)火加熱至沸，再以文火煎煮至5 000 ml原液，即0.05 g/ml的中藥原液，高壓滅菌后置4℃冰箱保存?zhèn)溆?，保質(zhì)期1個(gè)月。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

分離自醫(yī)院耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染患者的傷口分泌物，經(jīng)Vitek-2 Compact（購(gòu)自BIOMERIELIX公司）鑒定并經(jīng)平板生長(zhǎng)觀察證實(shí)為產(chǎn)生物膜的MRSA菌株。將保存的試驗(yàn)菌株接種于5%血平板，置37℃（ gSP‐9270MBE 隔水式恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）培養(yǎng)24 h，連續(xù)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)3次。選定質(zhì)控菌株ST-239，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

1.2.1 菌懸液制備

菌種復(fù)蘇，挑取菌落至3%胰蛋白胨大豆肉湯（Trypticase Soybroth， TBS）液體培養(yǎng)基中，1 30 r/min，37℃勻速振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，再以1：100比例重新接種至新的TBS中，1 30 r/min，37℃勻速振蕩培養(yǎng)195 min至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取菌液離心，6 000 r/min，15 min，用無(wú)菌PBS沖洗兩遍，然后混懸至×109 CFU/ml。

1.2.2 電鏡樣品制備

取約1×107 ml的菌懸液涂布于0.05 g/ml黃連素液的平板表面，置于37℃培養(yǎng)24 h后收集平板上的菌體。用PBS洗滌菌體沉淀3次后，將得到的菌體滴到載玻片上，制成菌懸液涂片。放入電鏡掃描使用的2.5%戊二醛磷酸緩沖液中保持穩(wěn)定3 h;0.1M PBS緩沖液沖洗2次，每次時(shí)限為15 min;加入1%鋨酸后固定1 h;0.1M PBS沖洗15min×2次;2%醋酸鈾水溶液染色30 min;50%、70%、90%酒精依次脫水，各15 min×1次;100%酒精脫水20 min×1次;100%丙酮脫水20 min×2次;1：1滲透：無(wú)水丙酮與包埋劑按1：1體積混合滲透菌體，并震蕩2 h;純包埋劑滲透菌體，并震蕩2 h;純包埋劑包埋，并置于烘箱內(nèi)聚合，37℃聚合24 h，45℃聚合24 h，60℃聚合48 h;染色：4%醋酸鈾染色20 min，枸櫞酸鉛染色5 min;將染色后的涂片拍照要求以單孔銅網(wǎng)進(jìn)行固定，利用電鏡透射進(jìn)行拍照觀察和記錄。對(duì)照組進(jìn)行空白的菌體，操作步驟相似，可參照實(shí)現(xiàn)。

2結(jié)果

兩組MRSA菌株在電鏡下的形態(tài) ? ?空白菌體對(duì)照組（不加黃連素液的菌懸液）MRSA菌株菌體透亮，無(wú)固縮，聚集成團(tuán)，偶見(jiàn)正在分裂的菌體。加黃連素液的菌懸液MRSA菌株菌體固縮，不成團(tuán)。

3討論

黃連作為多年生草本植物，主要來(lái)源有三種，分別是毛莨科植物黃連、三角葉黃連或云連，取上述三種中藥曬干得根莖即可，主要成份以小蘗堿為主（超過(guò)3.6%）[1～2]。黃連在中藥領(lǐng)域以清熱燥濕、瀉火解毒為主，但是該藥的抗菌譜也較廣，可以對(duì)多種細(xì)菌產(chǎn)生敏感抗菌作用[3～4]，如金黃色葡萄球菌等，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)至少高達(dá)9種以上的真菌有效果。本研究結(jié)果顯示，在形態(tài)學(xué)上正常的MRSA菌株菌體透亮，無(wú)固縮，聚集成團(tuán)，偶見(jiàn)正在分裂的菌體，增殖活躍;而經(jīng)黃連素液作用后MRSA菌株形態(tài)學(xué)上發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)菌體固縮，不成團(tuán)，增殖明顯受到抑制，并出現(xiàn)菌體死亡。從而證實(shí)：黃連素液確實(shí)對(duì)MRSA具有抑制作用。

通過(guò)電鏡觀察得出黃連素對(duì)MRSA有較好的抑菌作用，但具體在何環(huán)節(jié)發(fā)揮藥理作用及其具體的抑菌作用情況尚未確定，需要深入探討，提升中草藥抑菌的現(xiàn)代病理學(xué)理論研究水平。

參考文獻(xiàn)

[1]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，化學(xué)工業(yè)出版社，1990.275-276.

[2]王維琪.黃連有效成分的藥理研究與進(jìn)展[J].中醫(yī)臨床研究，2016，8（26）：147-148.

[3]姚冬婷，胡駿，張雪清，等.黃連對(duì)金黃色葡萄球菌體外抑菌活性的分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2017，32（7）：577-581.

[4]謝川東，文燕，曾昱偉，等.黃連抗菌活性成分研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，57（23）：85-88.