miR-106b通過PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路對(duì)Hcy誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移的影響

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病最常見的病因之一，是中風(fēng)、心肌梗死、不穩(wěn)定心絞痛和心臟性猝死的潛在原因，是一種動(dòng)脈壁的慢性炎癥疾病，主要累及大中型動(dòng)脈，尤其是血管分支和管腔迂曲明顯的部位，動(dòng)脈急性閉塞所致的心肌梗死和腦卒中是最重要的并發(fā)癥[1]。過度飲酒、吸煙、飲食不規(guī)律、長(zhǎng)期缺乏運(yùn)動(dòng)、肥胖可促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展，引起過早死亡[2]。血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth cells，VSMCs）是動(dòng)脈壁的主要成分之一，研究證明VSMCs 的異常增殖和遷移是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中重要的病理生理基礎(chǔ)，在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成和最終破裂中起著關(guān)鍵作 用[3～5]。所以尋找針對(duì)VSMCs 功能的策略對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化治療具有重要意義[2]。微小RNA（microRNA，miRNA）是22nt 左右的非編碼RNA，其通過抑制靶基因的翻譯或者降解mRNA 來調(diào)控基因的表達(dá)，從而對(duì)多種疾病的發(fā)生和發(fā)展產(chǎn)生影響[6～8]。研究證實(shí)，miR-106b 在心腦血管疾病[9]、子宮內(nèi)膜癌[10]、慢性淋巴細(xì)胞白血病[11]、肝癌[12]等多種疾病中發(fā)揮重要作用。戴冬偉等[13]研究顯示，miR-106b 在煙霧病患者血清中呈高表達(dá)，mTOR 信號(hào)通路與煙霧病發(fā)病可能相關(guān)。Zhang 等[9]研究顯示，上調(diào)miR-106b 可抑制動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Liu等[14]研究表明，重復(fù)性磁刺激可以調(diào)控miR-106b表達(dá)，刺激神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖。研究發(fā)現(xiàn)miR-106b 是一個(gè)評(píng)估癲癇的生物標(biāo)志物[15]。本研究分析動(dòng)脈粥樣硬化中miR-106b 的表達(dá)量，探討其通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路對(duì)Hcy 誘導(dǎo)的VSMCs細(xì)胞增殖和遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 收集我院2019年6～12月診斷為動(dòng)脈粥樣硬化42 例患者的血清（患病組）及25 例健康志愿者血清作為對(duì)照（對(duì)照組），參考相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，患病組為臨床動(dòng)脈粥樣硬化患者，其冠狀動(dòng)脈直徑較原動(dòng)脈管徑或相鄰節(jié)段管徑≥1.5 倍，且未定位（＞20mm 長(zhǎng)和/或包括動(dòng)脈長(zhǎng)度的1/3 以上）。患者及家屬均簽署知情同意書，本研究獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑 miR-106b mimics、miR-NC 均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；GAPDH 抗體購(gòu)于Cell Signaling Technology 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Rea-gent Kit、PCR 試劑盒SYBR Prime Script miRNA RT-PCR Kit 購(gòu)于TaRaKa 公司；VSMCs 細(xì)胞購(gòu)自上海生物化學(xué)細(xì)胞生物學(xué)研究所；細(xì)胞和蛋白提取試劑盒購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；PI3K、Akt、p-Akt、mTOR 等抗體購(gòu)自Abcom 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 參考相關(guān)操作[2，9]，細(xì)胞在37℃、5%CO2含10%FBS、100U/ml 青霉素、100mg/ml 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分為4 組，未加任何處理為Control 組，加入1mmol/L Hcy 為Hcy 組，轉(zhuǎn) 染miR-NC 為Hcy+miR-NC 組，轉(zhuǎn) 染miR-106b mimics 為Hcy+miR-106b mimics 組。根據(jù)Lipofecta- mine 2000 說明書操作。

1.2.2 qRT-PCR 檢測(cè) 提取細(xì)胞系的總RNA，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。按照逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒說明書指導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA，按照SYBR Prime Script miRNA RT-PCR 試劑盒說明，使用ABI Prism 7500 PCR 進(jìn)行RNA 水平的測(cè)定。miR-106b上游引物序列為5'-TGCGGCAACACCAGTCGATGG -3'，下游引物序列為5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGG T-3'；GAPDH 上游引物序列為5'-TTGGTATCGTGG AAGGACTCA-3'，下游引物序列為5'-TGCGGCAA- 3'。相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.2.3 MTT 實(shí)驗(yàn) 在細(xì)胞計(jì)數(shù)后，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24h，制備細(xì)胞懸液，選取0.1ml/孔細(xì)胞懸液接種于96 孔板，每培養(yǎng)24h 后，加入MTT 試劑，570nm 處測(cè)量吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.4 Wound healing 實(shí)驗(yàn) 把細(xì)胞接種到6 孔板中， 5%CO2孵育過夜，首先用記號(hào)筆在每孔的背面做好標(biāo)記，以確定位置，用PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞孔，把懸浮細(xì)胞去除，加入培養(yǎng)基后，5%CO2孵育。顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕的距離并記錄，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 制備蛋白樣本，SDS-PAGE電泳，結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜操作，將凝膠中的目的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用PBS 緩沖液沖洗PVDF 膜，分別進(jìn)行一抗孵育，再用PBS 緩沖液洗滌3 次，每次2min，進(jìn)行二抗孵育，再充分洗滌3 次，每次2min，進(jìn)行顯色，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 16.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料用±s表示，采用t檢驗(yàn)比較及單因素方差分析。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清和細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清中呈低表達(dá)（P＜0.01），見圖1；同時(shí)，miR-106b 在Hcy（1mmol/L） 誘導(dǎo)的VSMCs 中表達(dá)下調(diào)，而在轉(zhuǎn)染miR-106b 的VSMCs 中呈高表達(dá)（P＜0.01），見圖2。

2.2 miR-106b 對(duì)VSMCs 細(xì)胞增殖和遷移的影響MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，適當(dāng)濃度Hcy 能夠誘導(dǎo)VSMCs的增殖活力；與轉(zhuǎn)染miR-NC 相比，轉(zhuǎn)染miR-106b mimics 細(xì)胞的增殖能力顯著被抑制（P＜0.05），見圖3；同時(shí)，Wound healing 實(shí)驗(yàn)表明通過轉(zhuǎn)染miR-106b mimics 過表達(dá)細(xì)胞遷移率降低，細(xì)胞的遷移能力受到抑制（P＜0.05），見圖4。

2.3 miR-106b 對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響Western blot 結(jié)果顯示，Hcy 可以增加PI3K、Akt 和mTOR 蛋白含量；同時(shí)，與miR-NC 比較，PI3K、Akt、mTOR 表達(dá)量在轉(zhuǎn)染miR-106b mimics 的Hcy 誘導(dǎo)VSMCs 細(xì)胞中明顯下調(diào)（P＜0.05），見圖5。

圖1 qRT-PCR 檢測(cè)患病組和對(duì)照組血清樣本中 miR-106b 相對(duì)表達(dá)量

圖2 qRT-PCR 檢測(cè)不同細(xì)胞中miR-106b 相對(duì)表達(dá)量

圖3 MTT 檢測(cè)不同細(xì)胞的增殖情況

圖4 Wound healing 檢測(cè)不同細(xì)胞的遷移情況

圖5 Western blot 檢測(cè)PI3K/Akt/mTOR 蛋白的表達(dá)情況

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化在心血管疾病中最常見，該疾病涉及多種細(xì)胞因子參與，與脂質(zhì)代謝、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血管平滑肌細(xì)胞活動(dòng)及血小板活化有關(guān)。其中VSMCs 的增殖、遷移及侵襲是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的必要條件，活化VSMCs 促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的進(jìn)展和最終的破裂[16]。所以迫切需要有效的治療靶點(diǎn)來降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生率。有研究顯示[17]，miRNA 可能通過促進(jìn)相關(guān)靶mRNA 的降解及（或）抑制翻譯在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移過程。因此，本研究探討miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化患者中的表達(dá)及其通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路對(duì)VSMCs 細(xì)胞增殖和遷移的影響。

microRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，其在包含心腦血管疾病等多種疾病的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。研究表明，多種microRNA在心腦血管疾病中扮演著重要角色，包括miR-590、miR-98、miR-22、miR-365、miR-let-7c 等[17，18]。 miR-106b 與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，包括卵巢癌、癲癇、阿爾茲海默癥等。低表達(dá)miR-106b 可以作為阿爾茲海默癥的潛在標(biāo)志物。miR-106b 上調(diào)可抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣硬化內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化患者血清和Hcy 誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞中呈低表達(dá)，且轉(zhuǎn)染miR-106b mimics 后，Hcy 誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞增殖及遷移能力均顯著受到抑制，提示miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化中可能扮演抑制作用。

PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路在細(xì)胞分化、生長(zhǎng)中廣泛參與，是重要的調(diào)控因子，研究證實(shí)該通路與動(dòng)脈粥樣硬化疾病密切相關(guān)[19，20]。研究表明，Akt/mTOR 信號(hào)通路的選擇性抑制可通過激活巨噬細(xì)胞抑制動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)展，提高動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的穩(wěn)定性[21]。LncRNA ENST00113 在動(dòng)脈粥樣硬化中通過激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)抑制增殖、遷移。在動(dòng)脈粥樣硬化中氧化性低密度脂蛋白通過PI3K/Akt 激活mTOR，是平滑肌細(xì)胞增殖所必須的。本研究通過分析miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化中的表達(dá)，觀察其對(duì)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路的影響，結(jié)果顯示，與miR-NC 比較，PI3K、Akt、mTOR 表達(dá)量在轉(zhuǎn)染miR106b mimics 的Hcy 誘導(dǎo)VSMCs 中下調(diào)，證明Hcy 誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞增殖及侵襲可能與PI3K/Akt/mTOR 通路相關(guān)。

綜上所述，miR-106b 在動(dòng)脈粥樣硬化中呈低表達(dá)，并且通過PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路抑制Hcy誘導(dǎo)的VSMCs 細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果為后續(xù)相關(guān)機(jī)制研究提供參考，為治療動(dòng)脈粥樣硬化提供了一個(gè)可能的潛在靶點(diǎn)。