淺談固相合成類多肽原料藥的工藝控制

王華

【摘要】固相化學合成法是合成類多肽原料藥的重要手段之一，目前主要采用Fmoc方法進行合成。在工藝研究過程中，氨基酸縮合、樹脂肽裂解、轉型、反相制備純化和冷凍干燥等步驟，對原料藥質量均有不同程度的影響。本文論述了在制備工藝的不同步驟，對原料藥質量的影響因素以及相應的控制策略，從而達到工藝穩定可控，生產出優質原料藥。

【關鍵詞】固相合成法;多肽;原料藥;工藝控制;

【中圖分類號】TQ464.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-7225（2020）04-0013-01

1引言

隨著現代科技的不斷進步，醫藥研發領域取得了很大程度的突破。多肽類藥物作為醫藥的一個細分領域，生物活性廣泛。盡管多肽藥物問世時間較短，但是發展速度很快，近年來越來越多的多肽類新藥獲批上市。固相合成具有合成效率高和純度高的優勢，更容易實現自動化和工業化，在醫藥行業中被廣泛應用。

2固相合成原理

多肽固相合成法由Merrifield 開創，被授予了諾貝爾化學獎。固相合成法是選用合適的固相載體，將氨基酸逐個連接到載體上，最后將合成的多肽鏈從載體上釋放出來的一種新型合成方法。合成過程通常是從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。第一個氨基酸的羧基以共價鍵的形式與固體相載體結合，然后這一氨基酸的氨基與第二個氨基酸羧基反應，重復 （縮合→洗滌→去保護→洗滌→下一氨基酸縮合）步驟，連接成為長肽鏈^[1]。最后將肽鏈從樹脂中分離出來，再經過制備純化等工藝，即獲得所需目標產物。

3工藝控制

固相合成法克服了液相合成法中，每一步產物都需后處理的困難。在中間體監控方面相對較弱。需要研發人員對生產工藝的深入研究，降低粗肽中雜質含量。以下從氨基酸縮合、樹脂肽裂解、轉型、制備純化和冷凍干燥步驟進行闡述。

3.1氨基酸縮合

在氨基酸縮合過程中，監控縮合反應為茚三酮顯色法，此法靈敏度較高。此步驟容易產生消旋轉化的異構體雜質，縮合及脫Fmoc不完全形成的缺失肽雜質，以及反應試劑活性過高或反應條件劇烈形式的插入肽雜質。

常見易消旋化氨基酸有Cys、His和Phe，通常在縮合試劑中加入HOBT抑制其消旋，也可以降低反應溫度、使用高效縮合試劑、提高物料比等措施，進一步降低其消旋程度，控制異構體雜質。

缺失肽類雜質引入有三個途徑：①縮合反應不完全：可以通過提高物料比、高效縮合試劑和提高溫度等方式進行控制;同時需關注茚三酮顯色的假陽性現象。②脫Fmoc反應不完全：可以通過多次反應或提高哌啶濃度等方式進行控制。③困難位點：肽序列中含有Val，Ile，Tyr，Phe，Trp，Leu，Gln和Thr等氨基酸，相互比鄰或重復時，肽鏈舒展性不好，合成效率下降^[2]。可以改變溶劑體系和降低樹脂取代率來改善其縮合效果。

插入肽類雜質在易縮合位點更容易產生，可以通過降低反應條件，如反應溫度，堿性試劑用量（DIC，DIEA等），避免縮合反應過程中Fmoc脫落后繼續反應產生插入肽。

3.2樹脂肽裂解

按照肽序列進行氨基酸縮合后得到樹脂肽，需要將其與載體樹脂分割得到目標肽。一般采用TFA切割，切割過程中加入乙二硫醇，苯甲硫醚，水，三異丙基硅烷，苯酚等。主要作為碳正離子俘獲試劑，俘獲切割反應過程中生成的碳正離子，減少其對部分氨基酸側鏈的進攻導致的副反應。

此步驟容易產生氨基酸側鏈保護基脫落不完全（如Pbf、tBu等）、肽鍵斷裂、非天然氨基酸修飾側鏈的斷裂，含-SH肽的氧化/聚合等雜質，此步驟產生的雜質較多，也比較復雜。通常從裂解配方、反應濃度、裂解溫度、裂解時間等方面進行研究和控制，降低其后續制備純化步驟中難以清除的雜質。

3.3 轉型

多肽原料藥大多為醋酸鹽形式，樹脂肽采用含三氟乙酸配方進行裂解，所得粗肽中一般含約15%的三氟乙酸，需要對其進行轉鹽處理。目前主要方法有反相C18填料轉型、離子交換樹脂和化學方法除酸等，其中C18填料轉型的除去效果最好，但此方法操作繁瑣，成本較高。離子交換樹脂和化學方法可除去粗肽中大部分三氟乙酸，含量降低至1%左右。同時后續制備純化步驟也具有一定的除酸效果，從而進行控制。結合工藝簡繁程度和成本，目前這兩種方法更受研究者的青睞。

3.4 制備純化

在多肽原料藥工藝中，制備純化步驟是工藝中除雜最為關鍵的步驟。工藝中產生的相關雜質，均在此步驟中進行有效去除，從而達到原料藥純度要求。多肽序列的性質決定了純化條件，一般根據酸堿性選擇填料類型，根據溶解性選擇流動相組成，根據極性大小選擇梯度條件，同時也相互影響。

在純化主要條件確定后，進一步考察上樣量、溶樣體系、流動相PH、制備柱清洗等影響因素，結合純度和收率等指標，確定純化工藝。此步驟一般不會引入新雜質，仍需關注純化液在濃縮和貯存條件下的穩定性情況，避免在后處理過程中雜質含量增加。

3.5冷凍干燥

多肽類原料藥大多采用冷凍干燥方式獲得成品，凍干步驟一般在有關物質方面較為穩定，主要與原料藥的一些化檢指標（如醋酸含量、水分、溶液澄清度等）相關。凍干的影響因素有批量差異、凍干液體積、樣品濃度、凍干液面高度和凍干液溶劑組成，以及凍干程序和設備穩定性^[3]。工藝開發前期確定其關鍵影響因素，在中試放大階段進一步考察確定，從而達到穩定可控的生產工藝。

綜上所述，由于多肽藥物對某些疾病具有獨特的治療效果，在過去幾十年里，多肽的應用在生物化學家和醫務人員手中得到了越來越多的關注。多肽合成的出現和發展，促進著醫藥領域的進步。多肽固相合成目前主要用于中短肽鏈的合成，從氨基酸縮合至冷凍干燥的工藝步驟中，每個步驟均有諸多的影響因素，需要進行深入全面的工藝研究，從而開發出穩定可控，優質的原料藥。對于固相合成中氨基酸縮合反應監測的弱點，需尋找更合適的監測手段，促進多肽固相合成技術的發展。

參考文獻：

[1]黃蓓. 多肽固相合成研究進展[J].河南化工.2018，30（1）： 28-30.

[2]韓香，王德心. 多肽合成中“困難序列”的縮合研究進展[J].藥學學報.2007.42（2）：111-117.

[3]蔡繼蘭.藥品凍干過程中各關鍵環節的控制及常見問題分析[J]. 藥學研究.2013.32（3）.179-182.