小鼠SDF-1/CXCR4介導的AKT與ERK通路抑制對延緩骨折愈合的影響

唐昊 陳順有 盧曉坤 陳福明

【摘要】 目的：探討SDF-1/CXCR4介導通路對小鼠骨折愈合的影響。方法：40只C57BL雄性小鼠隨機分為抑制組與對照組，采用切開暴露股骨中段制造股骨干橫行骨折，插入髓內針制作小鼠骨折愈合模型，抑制組小鼠每次每只每12小時1.25mg/kg局部皮下注射CXCR4抑制劑AMD3100，對照組小鼠注射等量磷酸緩沖鹽溶液;在模型構建后第1、3、5、8周處死小鼠，采用放射學X線片觀測其影像學改變;采用免疫組織化學觀測指標SDF-1、ERK、AKT在組織中的表達水平;采用實時定量熒光PCR觀測指標COL1、COL2、CXCR4、VEGF在組織中的表達水平。結果：小鼠單側開放性股骨干橫形骨折+髓內針固定模型構建成功，適用于小鼠骨折愈合的研究。兩組COL1、CXCR4、VEGF在組織中表達均逐漸上升，至第3周時達到高峰，后逐漸下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）;兩組COL2均在第1周即達到高峰，后快速下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）。兩組SDF-1、ERK、AKT在組織中表達均逐漸上升，至第3周時達到高峰，后逐漸下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）。結論：在小鼠中抑制SDF-1/CXCR4通路將會延緩骨折愈合。

【關鍵詞】 骨折愈合 AMD3100 SDF-1 CXCR4

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.19.003 文獻標識碼 A 文章編號 1674-6805（2020）19-000-04

Effect of SDF-1/CXCR4 Mediated AKT and ERK Pathway Inhibition on Delayed Fracture Healing in Mice/TANG Hao， CHEN Shunyou， LU Xiaokun， CHEN Fuming. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（19）： -9

[Abstract] Objective： To investigate the the effect of SDF-1/CXCR4 pathway on fracture healing in mice. Method： A total of 40 C57BL male mice were randomly divided into the inhibition group and the control group. All mice operated by exposing the middle part of femur and making transverse fracture of femoral shaft， inserting intramedullary needle to make model of fracture healing in mice. The inhibition group was injected CXCR4 inhibitor AMD3100 1.25 mg/kg every 12 hours at a time by partial subcutaneous. The control group was injected with the same amount of phosphate buffer solution. The mice were sacrificed at week 1， 3， 5 and 8 after model construction， and radiological X-ray was used to observe the imaging changes. The expression levels of SDF-1， ERK and AKT in tissues were used as immunohistochemical observation indexes. Real-time quantitative fluorescence PCR was used to observe the expression levels of COL1， COL2， CXCR4 and VEGF in tissues. Result： The model of fracture healing in mice was established successfully by unilateral open transverse fracture of femoral shaft+intramedullary needle fixation. The expressions of COL1， CXCR4 and VEGF in the tissues of the two groups increased gradually， reached the peak at week 3， and then decreased gradually. In the same period， the control group was higher than the inhibition group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The COL2 in both groups reached its peak in the first week， and then decreased rapidly. In the same period， the COL2 in the control group was higher than that in the inhibition group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The expressions of SDF-1， ERK and AKT in the tissues of the two groups increased gradually， reached the peak at week 3， and then decreased gradually. Moreover， the expression of SDF-1， ERK and AKT in the control group were higher than those in the inhibition group at that time， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion： Inhibition of SDF-1/CXCR4 pathway in mice will delay fracture healing.

[Key words] Fracture healing AMD3100 SDF-1 CXCR4

First-authors address： Fuzhou Second Hospital Affiliated to Xiamen University， Fuzhou 350007， China

隨著年齡的增長、骨質的疏松，骨折的發生率將逐漸增高。根據流行病學調查，在中國，全年齡骨折發病率為3.21%，由此，可推測大約有4.39億人發生過骨折[1]。骨折的成功愈合依賴于炎癥、血管形成、軟骨形成和成骨細胞的募集、遷移和歸巢[2]。有文獻[3]指出，將小鼠CXCR4基因敲除，在骨折愈合早期骨與血管新生都會下降。因此，SDF-1/CXCR4通路可能參與骨折愈合和血管新生。本實驗旨在探究SDF-1/CXCR4通路可能對骨折預后的影響，具體如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物：SPF級C57BL雄性小鼠40只（福建中醫藥大學實驗中心提供），體重20～25 g。

1.2 小鼠骨折模型

使用5%水合氯醛（6 μl/g，本實驗約0.15 ml/只）麻醉C57BL小鼠，剃去體毛，擺好體位。75%酒精消毒3次，上至腹股溝下至腳趾，無菌紗布中央剪1.5 cm左右孔洞，覆蓋操作區。于股骨外側中部做一橫行切口，長度大約1.5 cm，暴露股四頭肌肌間隙，用無齒鑷鈍性分離，暴露股骨，于膝關節處使用24 G注射器針頭鉆入股骨形成髓內針，使用線剪在股骨中段垂直股骨干做一骨折端，斷端可見注射器針頭，則表示模型構建成功。術中使用無菌紗布壓迫止血，使用生理鹽水稀釋注射用青霉素鈉粉末沖洗傷口，生理鹽水清洗傷口3次，用絲線縫合傷口處皮膚。

1.3 SDF-1/CXCR4通路抑制

對40只C57BL小鼠進行隨機分組，抑制組20只，對照組20只，使用苦味酸標記小鼠。抑制組術后每12小時右側股骨骨折斷端局部注射CXCR4抑制劑AMD3100（1.25 mg/kg，本實驗約0.15 ml/只），分別持續1、3、5、8周;對照組在同樣部位同樣時間注射等量PBS。

1.4 放射學分析

術后第1、3、5、8周使用相同方法麻醉小鼠，雙下肢外展外旋體位拍攝X線片，請兩位骨科醫生評估骨痂、骨折線等，以評估骨折愈合情況。

1.5 標本處理

術后第1、3、5、8周，每組每周處死5只，共40只，麻醉后脫頸處死小鼠，取右下肢，除去周圍軟組織，剝離出股骨，拔出髓內針。PCR組織迅速放入凍存管，投入液氮中。完成取材后迅速放入-80 ℃冰箱保存。常規脫鈣。

1.6 組織形態學測量與分析

免疫組化：切片60 ℃恒溫箱烤制過夜，常規脫蠟至水;微波抗原修復;磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，5 min/次;內源性過氧化酶阻斷劑浸泡10 min;PBS漂洗3次，5 min/次;血清封閉30 min，4 ℃冰箱孵育一抗過夜（抗體濃度：AKT 1∶200，ERK 1∶200，SDF-1 1∶140）;磷酸緩沖鹽溶液漂洗3次，5 min/次;DAB顯影2 min，超純水終止顯影;蘇木精染30 s，3道超純水漂洗;晾干封片。

1.7 實時定量PCR檢測

使用Vazyme公司實時定量PCR檢測試劑盒，具體詳見試劑盒說明書，目的基因引物序列見表1。

1.8 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件進行處理，計量資料以（x±s）表示，均采用正態性檢驗后兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 放射學觀察

術后第1周，兩組骨折線均明顯，有骨痂形成，抑制組稍少于對照組;術后第3周，對照組有大量骨痂生成;術后第5周，抑制組仍可見骨折線，對照組骨折線幾乎不可見，骨折基本愈合;術后第8周，抑制組與對照組骨折線均不明顯，骨折基本愈合，見圖1。

2.2 兩組各周實時定量熒光PCR檢測結果比較

兩組COL1、CXCR4、VEGF在組織中表達均逐漸上升，至第3周時達到高峰，后逐漸下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05）;兩組COL2均在第1周即達到高峰，后快速下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 兩組各周免疫組織化學檢測結果比較

兩組SDF-1、ERK、AKT在組織中表達均逐漸上升，至第3周時達到高峰，后逐漸下降，且同時間對照組均高于抑制組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表3。

3 討論

骨折的修復是一個復雜的生物學過程，依賴于間充質干細胞激活后在骨折間隙中積累，增殖分化形成成骨細胞系，最后形成骨痂，重塑為新生骨。許多因素都會對骨折修復產生影響，包括祖細胞的缺乏或受損，其激活，歸巢，增殖和分化為成骨細胞譜系的分子調控紊亂，或缺乏適當的代謝環境來進行骨折修復等[4]。

本研究的目的在于研討SDF-1/CXCR4通路對骨折愈合的影響，通過抑制此通路發現，骨折愈合相關指標均在前3周中明顯升高，信號介導的下游通路也隨之升高，證明SDF-1/CXCR4通路通過下游AKT與ERK等通路影響骨折愈合，而同時間段對照組均高于抑制組，證實抑制SDF-1/CXCR4通路將會抑制骨折愈合。SDF-1/CXCR4通路在許多生理與病理過程中起重要作用，Wei等[5]研究表明，缺氧激活SDF-1/CXCR4通路，動員和募集祖細胞調節缺氧的肺動脈高壓與血管重塑，而使用AMD3100會抑制抑制SDF-1/CXCR4通路，抑制細胞周期與肺動脈平滑肌的細胞增殖。Kucia等[6]認為SDF-1在調節正常造血干細胞（HSC）的運輸及其在骨髓中的歸巢中起著關鍵作用。SDF-1/CXCR4通路在骨折修復中除了對細胞增殖、歸巢有促進作用以外，對細胞募集同樣也有促進作用，文獻[7-9]報道，SDF-1在缺氧缺血的環境下高表達，在機體出現損傷時，SDF-1會在損傷部位高表達。COL1、COL2與軟骨形成有關[10-11]，本研究中COL2表達量在第1周即達到頂峰，之后快速下降，第5、8周幾乎無表達，COL1表達量在前3周較多，說明在前3周中有大量軟骨細胞形成，之后迅速分化形成成骨細胞。COL1與成骨仍有相關[12]，故在第5、8周仍有表達。VEGF是調節血管發育和血管生成最重要的生長因子之一，由于骨是高度血管化的器官，血管的發育和生成對骨骼發育早期至關重要，VEGF能夠增強成骨細胞活性、刺激增殖、分化從而加速骨形成[13]。Berendsen等[14]認為，成骨細胞衍生的VEGF會刺激間充質細胞向成骨細胞分化，抑制其向脂肪細胞分化，維持人體骨穩態。在本實驗VEGF表達量對照組高于抑制組，與骨生成趨勢一致，這與上述文獻所表達的VEGF可以促進骨質生成相一致。但是也有文獻顯示使用VEGF與AMD3100作用于小鼠股骨干骨折愈合模型可以加快骨折愈合[15-19]，與本研究結果相悖的原因可能是由于使用VEGF與AMD3100同時作用，VEGF對骨折的正向作用超過AMD3100對骨折愈合的負面作用。

總而言之，SDF-1/CXCR4通路通過介導ERK和AKT通路調節骨折處血管新生、骨質生成等生理過程，AMD3100作為CXCR4的抑制劑抑制了SDF-1/CXCR4通路導致血管新生、骨質生成等相關指標同時降低，故SDF-1/CXCR4通路可作為研究骨折愈合的關鍵靶點，為研究骨折愈合提供一個思路。本研究的優勢在于通過建立骨折后4個時間點觀察骨折愈合情況，前后對比，更具有說服力，小鼠骨折愈合模型建立簡單便捷，快速有效，很好地模擬了人體骨折。但本研究的不足之處在于無客觀指標觀察骨痂新生、骨質生成，僅通過X線觀察骨折端，由經驗豐富的臨床骨科醫生進行判斷，具有一定的偏倚性。本研究下一階段將從基因層面進一步觀測通路介導信號，并通過客觀指標觀察骨痂新生、骨質生成的具體數值。

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（收稿日期：2020-04-08） （本文編輯：馬竹君）

*基金項目：福建省衛生計生科研人才培養項目（2017-CX-46）

①廈門大學附屬福州第二醫院 福建 福州 350007