多肉植物組織培養中污染現象及預防措施

李浩 羅偉沼 石浩 楊曉瑩 王德信

[摘 要] 污染是多肉植物組織培養過程中的常見問題，嚴重影響了多肉植物的組培成功率。為了提高多肉植物組培苗的成活率，本文對多肉植物組織培養過程中出現的污染及其產生原因進行分析，并提出防止污染使死亡率降至最低的有效方法，為多肉植物組織培養提供技術支持。

[關鍵詞] 多肉植物;組織培養;污染;預防措施

[中圖分類號] S682.33 [文獻標識碼] B [文章編號] 1674-7909（2020）21-96-2

隨著經濟的發展及醫療保健業的進步，人們越來越向往高質量的生活，并出現了回歸自然的潮流，人們越來越熱衷養花來陶冶情操、緩解壓力。多肉植物是指某些營養器官具有發達的薄壁組織可以貯藏大量的水分，在形態結構上肥厚多汁的一類植物。多肉植物品種繁多、管理簡單、抗逆性強、顏色豐富、造型各異、易種植以及對土壤要求不高，并具有良好的空氣凈化功能。此外，多肉植物澆水少，屬于典型的懶人植物，近年來逐漸成為深受廣大消費者喜愛的景觀植物。但是，多肉植物在長期栽培過程中存在質量退化現象，珍貴的多肉植物成活率低、成本高;在自然條件下，短時間內繁殖非常困難。通過組織培養技術可有效解決上述問題。利用多肉植物葉片、莖尖等作為外植體，通過誘導愈傷組織、叢生芽分化、生根和無菌苗移栽等多個步驟建立高效的快速繁殖體系，能有效加快多肉植物繁殖的工廠化進程。但在多肉植物組織培養過程中，無菌苗經常會出現污染現象，嚴重影響多肉植物組織培養效果。本文積極探討多肉植物組織培養中污染產生的因素，探尋預防策略，為多肉植物組織培養提供技術支持。

1 多肉植物組織培養中污染現象及其產生的原因

污染是在組織培養過程中，由于試驗材料、環境等滅菌不徹底等原因，使細菌、微生物混入培養基中，從而產生細菌或者霉菌導致培養失敗的現象。因此，必須嚴格操作植物組織培養的每一步，將細菌、霉菌等微生物扼殺在搖籃里。

多肉植物組織培養污染現象主要由細菌和真菌造成的。細菌性污染是影響多肉植物組培的一種最主要因素，細菌種類主要是芽孢桿菌屬[1]，其次是假單胞菌屬，細菌體積小，傳播途徑多樣化，往往發生于接種早期，7 d內即可顯現出來，并且極易擴散，在培養材料周圍表現出水漬狀、斑塊狀，造成很多植物材料壞死。細菌來源主要為植物材料和接種用具等。真菌污染主要是霉菌（青霉菌為主）[2]，受真菌污染后多肉植物材料很快變黑，一般7 d左右能看到絨毛狀或者絮狀菌絲，菌落較大，多呈黑色。

污染的原因主要有以下幾個方面。一是培養基出現污染。培養基是植物離體培養組織賴以生存的營養基質，是植物組織培養提供營養物質的重要來源。培養基成分中含有重要的營養物，主要包括大量元素及微量元素。在培養基滅菌過程中，其中任何一種營養物質氧化或者滅菌不充分（壓力過大或過小、滅菌時間較短等）都會導致培養基遭到污染。二是儀器、用具出現污染。在接種過程中用到的試驗儀器和試驗用具，如鑷子、剪刀、濾紙等，如果攜帶大量細菌，而且沒有進行高溫滅菌或滅菌不徹底，那么會導致微生物殘留、細菌增生。三是無菌操作技術不規范[3]。無菌操作不規范會將大量微生物帶入培養基，進而導致外植體被污染，最終無菌苗出現大面積污染。四是沒有嚴格進行消毒滅菌。在組織培養過程中沒有按照正確的操作步驟進行消毒滅菌，漏掉其中的任一環節都會導致植物體殘留大量細菌。五是外植體滅菌不徹底。組織培養工作中最重要的一個環節是外植體滅菌，多肉植物莖葉中含有大量水分，如果滅菌不充分，培養過程中大量水分外泄，易滋生細菌，導致材料污染。

2 多肉植物組織培養污染現象的預防措施

在組織培養過程中嚴格控制無菌接種操作的每個環節，是控制組培污染的重要措施。無菌操作直接影響培養材料及培養基的污染率[4]，是組織培養控制污染的關鍵過程。針對以上污染產生的原因，在多肉植物組織培養過程中應注意以下幾點。

2.1 所用試劑與主要用具嚴格消毒滅菌

試驗過程中用到的培養基需進行嚴格的高壓蒸汽滅菌，較長時間不用可以放在4 ℃冰箱儲存備用。接種用的鑷子、剪刀、接種瓶、濾紙和培養皿等使用用具也需進行高壓蒸汽滅菌，一般121 ℃滅菌20 min效果較好。激素類試劑適合選用抽濾滅菌方式，一般用0.22 μm濾頭抽濾滅菌。

2.2 選擇合適試驗材料

多肉組織培養工作的第一步是選擇合適的外植體，外植體種類直接影響組織培養的效果。多肉組織培養中葉片常常被選擇作為外植體，但是如果選擇雨天取材，往往細菌較多。晴天取材，由于陽光紫外線照射，具有一定殺菌效果，材料帶菌相對較少。因此，選擇外植體時，應選擇生長旺盛部位，并在晴天取材[5]，以保證多肉植物組培效果佳。

2.3 選擇適宜的滅菌方式

由于多肉植物暴露在自然環境中，外植體會攜帶大量細菌。此外，多肉植物葉片多絨毛，不易滅菌，因此多肉植物外植體滅菌消毒一定要嚴格按照操作步驟進行。多肉植物外植體滅菌應采用流水沖洗、洗衣粉浸泡、升汞及酒精消殺等方法，時間相對一般植物要長。具體操作為先將外植體用蒸餾水沖洗20～30 min，將洗衣粉放入盛有蒸餾水的燒杯中，攪拌并使其充分混勻，之后將多肉植物放到燒杯中，浸泡20 min;再輕輕搓洗葉片，用蒸餾水沖洗20～30 min，用0.1%升汞溶液浸泡10～15 min、75%酒精浸泡20 s，最后用無菌水沖洗3～5次，放入已滅菌的培養皿中的濾紙上吸水備用。這種滅菌方式效果佳。

2.4 嚴格實施標準化無菌操作

無菌操作人員要自身做到盡量少帶菌，試驗前穿隔離衣，用水和肥皂洗凈雙手，裸露手臂部位噴75%酒精，再進入無菌操作室。無菌操作前，將雙手再用75%酒精噴霧消毒，將解剖刀、剪刀、鑷子等金屬試驗工具用95%乙醇浸泡消毒，用乙醇燈外焰灼燒滅菌，后置于支架上冷卻備用;操作過程中動作要迅速快捷，盡量減少培養材料及器皿、工具等在空氣中的暴露時間;燃燒的酒精燈附近微生物無法存活，相對安全性高，操作以靠近酒精燈為宜。同時，在無菌操作過程中，一定避免外部無關人員進出，可有效降低污染概率。

2.5 嚴格試驗環境及試驗場所滅菌

必須將無菌接種間、培養室等房間進行高錳酸鉀、甲醛熏蒸或噴霧滅菌。超凈工作臺需要進行紫外殺菌消毒20 min以上。如果用光照培養箱或者人工氣候室進行培養，也需要用75%酒精進行全面殺菌消毒。

培養室的溫度、濕度與污染率密切相關，高溫高濕適合細菌生長，造成雜菌生長，所以污染率高;空氣干燥不利于細菌繁殖，污染率低。因此，在多肉植物組織培養過程中應適當降低培養室濕度，以有效降低污染率。

3 結語

多肉植物組織培養是有效解決多肉植物快速繁殖的重要技術，不僅有利于多肉植物的大規模生產，而且可有效保護多肉植物物種的多樣性。但由于多肉植物組織含水量高，莖葉生長絨毛，在組織培養過程中操作不慎易造成嚴重污染，克服污染成為多肉植物組織培養中的關鍵技術。完善多肉植物組培技術，建立針對不同科屬多肉植物的組培方案，優化多肉植物組培快繁體系，降低污染率，提高多肉植物組培效率及成功率，才能更好地造福人類。

參考文獻

[1]方麗，王連平，茹水江，等.植物組培過程中污染微生物種類及其季節性的變化[J].浙江農業學報，2013（2）：86-89.

[2]王洪波，郝會軍，丁雪珍，等.組培環境中污染菌種類初探[J].濰坊高等職業教育，2007（1）：43-45.

[3]朱小虎，王曉煒，米立剛.植物組織培養中存在的問題及改進方法[J].新疆農業科學，2006（s1）：95-98.

[4]趙佐敏，艾勇.植物組織培養過程中的污染原因及控制措施[J].貴州農業科學，2004（1）：61-62.

[5]紀純陽，矯麗曼，劉巍，等.植物組織培養中污染產生的原因及防止措施[J].遼寧林業科技，2011（2）：43-47.

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃項目（201710455124）;山東省重點研發計劃項目（2019GNC106113）;山東省高等學校青創科技支持計劃;菏澤學院現代農業研究中心。

作者簡介：李浩（1997—），男，專科在讀，研究方向：植物組織培養。

通信作者：王德信（1975—），男，博士，副教授，研究方向：植物基因功能。