桔梗組織培養存在的問題及對策

馮淑月 黃玥明 張偉 王士杰

[摘 要] 本文對桔梗組織培養技術研究現狀及存在的關鍵性技術問題展開綜述，針對褐化因素、污染、玻璃化等影響組培效果的主要問題給出相應解決措施，以期為桔梗組織培養規模化生產提供理論基礎。

[關鍵詞] 桔梗;組織培養;褐變;污染

[中圖分類號] S567.239 [文獻標識碼] B [文章編號] 1674-7909（2020）21-94-2

桔梗（Platycodon grandiflorum）又名六角荷、鈴鐺花等，其根可入藥，為桔梗科多年生草本植物，是我國常用的重要中藥材，主產于我國東北、華北、華東、華中等地區，在世界各個地區均廣泛種植[1]。植物組織培養技術指的是基于植物細胞全能性進行植物培育研究的一種技術[2]。目前，桔梗組織培養中存在諸多因素影響桔梗愈傷組培誘導和培養，且存在易褐化、玻璃化等問題，同時污染問題是影響桔梗組培效果的主要因素，亟待優化上述問題。

1 桔梗組織培養外植體選擇及過程

1.1 桔梗組織培養外植體的選擇

桔梗的外植體選擇對后續試驗的有序進行有重要影響。桔梗外植體不同生理部位和生理狀態的不同，誘導效果和誘導出愈傷組織的誘導率也不同。采用桔梗葉片、莖段和根作為外植體，后續培養過程中均具有誘導出愈傷組織且發育成苗的能力。嚴一字等采用無菌苗的葉片、莖段和根段作為試驗材料，培養時均能誘導出愈傷組織，還發現不同外植體在誘導培養階段最佳誘導培養基的配比不同[3]。誘導階段選用葉、莖段和上胚軸作為外植體比較發現，上胚軸作為外植體可以縮短誘導時間，且可以簡化培養基。

1.2 桔梗組織培養過程

1.2.1 初代培養。目前，植物組織培養中最常見的培養基有MS、B5、White、N6、WPM和Anderson等種類。研究表明，以葉片作為外植體時選用N6培養基可以直接誘導出苗，效果最好，莖段為外植體時選用MS培養基效果最好。曲生嬌在誘導叢生芽階段以帶葉節莖段、葉片作為外植體，利用MS基本培養基并添加0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[4]。王桂梅等以桔梗莖段作為外植體，附加不同濃度的6-BA和NAA，得出最佳誘導桔梗外愈傷組織的配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L[5]。較高濃度的6-BA有利于愈傷組織的形成，但濃度過高會誘導腋芽形成簇狀分生組織，影響小苗的形成速度。

1.2.2 繼代培養。繼代培養的基本培養基與初代誘導培養及類型基本一致，但目的不同。秦梅等在增值培養時發現6-BA濃度過高或過低均會抑制側芽的萌發，影響繼代材料的擴大[6]。張燕等在桔梗叢芽增值試驗時，使NAA濃度相同，隨著6-BA濃度的增加，小苗的增值倍數也增加，說明6-BA對桔梗繼代誘導起促進作用[7]。繼代培養時，發現隨著NAA濃度增加，叢生芽的增值倍數呈現負相關。

1.2.3 生根培養。桔梗的組培苗不添加外源激素均能生根，但根和苗的長勢均較弱。在桔梗生根培養時，隨著NAA濃度的升高生根數和生根率均會升高，但NAA濃度過高時，生根時間會延長，生根數、生根率均會降低。

2 桔梗組織培養中存在的問題

2.1 褐變現象

褐變又稱“褐化”，是指培養材料向培養基中釋放褐色物質，致使培養基逐漸褐變，培養材料隨之褐變甚至死亡的現象。桔梗組織培養引起褐化的主要機理是酶促反應[8]，造成褐變的原因有很多，主要包括植物的種類和基因型、外植體的類型和生理狀態、外植體的大小和采樣時間、培養條件和培養基成分等。

2.2 污染現象

污染是指在植物組織培養過程中，由于真菌、細菌等微生物的侵染，在培養容器中滋生大量的菌斑，導致培養材料不能正常生長發育的現象[9]。在桔梗的組織培養過程中，污染常有發生，造成污染的原因有很多。例如，器具消毒不徹底，外植體滅菌不徹底，接種操作不當，接種環境不干凈，超凈工作臺區域被污染，外植體材料內部消毒不徹底等均會引發污染，以上因素均是組織培養過程中較難控制的問題。

2.3 玻璃化現象

玻璃化是指在培養過程中培養材料呈半透明狀態，結構組織發育成畸形的現象。玻璃化現象一般出現在繼代培養過程中。細胞分裂素濃度過高，細胞分裂素與生產素相對含量高，培養基中離子種類比例不適、瓊脂和蔗糖濃度過低，培養條件不適宜，如不良培養環境、溫度過高、光照時間不足和通氣不良等因素均會引起玻璃化現象。

3 解決桔梗組織培養問題的有效措施

3.1 褐變防治措施

首先，桔梗組織培養過程中，選擇外植體時，生長季節植物體內的酚類化合物較多，所以盡量選擇在早春或者晚春取材，一般選擇幼齡植株嫩莖作為外植體。外植體切口越大越容易發生褐化，外植體選材宜大不宜小，外植體切口宜小不宜大。其次，培養材料預處理時，要采用流水沖洗，在5 ℃左右處理12～24 h，消毒后接種在只含有蔗糖的培養基上5～7 d，使外植體中的酚類物質部分滲透到培養基中。取出外植體，用科學的方法清洗干凈，再接種到適當的培養基中，可在一定程度上避免外植體褐化。其次，培養基應選擇適當的無機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平與組合以及添加一些抗褐變劑，可減輕褐變的發生。添加抑制劑、吸附劑、活性炭、抗壞血酸可有效減輕組織培養過程中的酶促褐化現象。加入抗壞血酸的培養基發生褐變的概率小于不加的培養基。檸檬酸等也能夠有效避免或減輕褐變現象。培養初期應嚴格控制培養條件，采用低溫（15～20 ℃）、黑暗、弱光環境，可有效防止高光和高溫引起褐化。對容易發生褐變的材料可間隔12～24 h再轉瓶培養，這樣連續處理7～10 d后，褐變現象會得到一定程度的控制。

3.2 污染防治措施

首先，進行組培室的消毒滅菌。保證組培接種室無菌、干凈、整潔，能夠有效防止污染。每周對組培室進行一次大掃除和徹底的消毒滅菌;接種室和培養室要求密閉、干燥、保持與外界環境相對隔絕的狀態，減少與外界的空氣對流及微生物與塵埃的浸入，嚴格控制光照、溫度、濕度、空氣等各種生態因子。其次，加強培養容器和培養基的消毒滅菌處理。培養瓶、試管等容器和封口用的蓋子、耐高溫的塑料膜等物品在用前均要經過徹底清洗、晾干。配制好的培養基分裝后應立即高壓蒸汽滅菌，放置兩三天，等到培養基表面和內部無雜菌污染的情況下可認為滅菌徹底，進行接種工作。再次，注意無菌操作。接種工作人員應嚴格按照無菌操作要求，規范熟練地進行每一步操作，可減少操作不當引起的污染。最后，清除污染傳播源。組織培養過程中污染是不可避免的，一旦發現培養污染物，應及時處理污染培養瓶，把污染物從培養室轉移出去，再對污染物進行高壓滅菌消毒，清洗干凈待用[10]。

3.3 玻璃化防治措施

選擇外植體時，優先考慮不易玻璃化的基因型及部位，選擇有助于降低玻璃化的頂芽作為外植體[11]。配制培養基時，添加外源生長調節劑如IAA、GA3、ABA，可減小玻璃化苗的出現。降低銨態氮濃度的同時提高硝態氮的含量，在大規模生產中成效顯著。適當調整瓊脂濃度也可防止玻璃化的產生。添加有機物根皮苷、添加植物生長調節劑合成前體，如ACC，或添加適宜濃度的活性炭，均可有效抑制組培苗玻璃化的形成。改善培養條件，盡量采取光照培養，在適宜的光照時間內適當提高光照強度;確定桔梗材料的適宜培養溫度范圍;選擇適宜的濕度條件;適當的通風降低培養容器中的濕度等，均有利于防止組培苗玻璃化現象發生。

4 結語

目前，藥用植物組織培養存在諸多不可調控因素，如培養條件、生長因子、污染原因、褐化現象和玻璃化因素等。目前，桔梗組織培養也僅限于試驗研究，不利于大規模化生產。在科技迅速發展的今天，隨著植物生理學、生物化學、組織培養學、植物學等學科的不斷滲透及各方研究的不斷合作，將會逐步解決組織培養技術中的難題，避免不可控因素的出現，保證組培效果。

參考文獻

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[2]張東旭，周增產，卜云龍，等.植物組織培養技術應用研究進展[J].北方園藝，2011（6）：209-213.

[3]吳京姬，吳基日，嚴一字，等.培養基組成對桔梗組織培養的影響[J].延邊大學農學學報，2006（1）：18-23.

[4]曲生嬌.桔梗組織培養研究[D].吉林：吉林農業大學，2012.

[5]王桂梅，賀美忠，楊富.桔梗組織培養技術的研究[J].安徽農學通報，2012（7）：70-71.

[6]秦梅，關文林，段瑋屏，等.桔梗莖段的組織培養及植株再生[J].云南農業，2004（8）：8.

[7]張燕，黎斌，張瑩，等.桔梗植株再生體系的建立及試管內開花現象[J].陜西農業科學，2015（10）：18-22，39.

[8]王棟，玉永雄，胡艷，等.植物組織培養中的褐化現象及其防止措施[J].黑龍江農業科學，2008（1）：7-10.

[9]溫璐華，武瑞娜.植物組培內生菌污染的防治措施[J].防護林科技，2020（2）：83-85.

[10]劉文靜.植物組織培養中常見污染類型及防控技術探討[J].南方農業，2019（Z1）：130-131.

[11]李婭莉，張健，潘遠智.觀賞植物組織培養過程中玻璃化現象與解決措施進展[J].四川農業大學學報，2004（3）：278-282.

基金項目：吉林農業科技學院大學生科技創新項目“桔梗的組織培養及抗鹽堿性研究”（2019007）。

作者簡介：馮淑月（1995—），女，本科在讀，研究方向：中草藥栽培與鑒定。

通信作者：王士杰（1978—），男，博士，副教授，研究方向：中草藥栽培與加工。