具有拮抗葡萄灰霉菌的生防酵母菌分離與篩選

張棟園，王曉妍，李 寧*，潘巨忠

(1.天津農(nóng)學(xué)院 園藝園林學(xué)院，天津 300384；2.寧波市鄞州賽弗兌食品科技有限公司，浙江 寧波 315100)

葡萄灰霉病(graymold)是由灰葡萄孢(Botrytiscrnerea)引起的一種比較常見的并且危害非常嚴(yán)重病害，目前全球范圍內(nèi)發(fā)生較多且危害比較嚴(yán)重的病害,在生長期及貯藏期均可發(fā)生[1-2]。目前防治葡萄灰霉病主要以化學(xué)藥物防治為主，但由于化學(xué)防治的種種弊端，葡萄灰霉病害的生物防治研究已經(jīng)受到廣大研究者的普遍關(guān)注。拮抗酵母菌作為采后生物防治的新方法，具有保護(hù)環(huán)境、安全的特點(diǎn)，可以替代化學(xué)殺菌劑[3-5]。酵母菌不產(chǎn)生毒素，代謝產(chǎn)物天然、易分解，對(duì)人體不會(huì)構(gòu)成威脅，并且大量存在于水果、蔬菜的表面，且許多酵母菌已經(jīng)成為食品工業(yè)中重要的添加劑，具有較好的應(yīng)用基礎(chǔ)[6-7]。近年來，雖然拮抗酵母菌在多種果實(shí)采后病害防治上取得一定的進(jìn)展[9]。但是，真正應(yīng)用于葡萄采后病害防治的報(bào)道還很少見。為提高葡萄采后的生物防治效果，筆者從不同食材(蘋果、葡萄、梨、香蕉、石榴、芒果、楊桃，木瓜中分離篩選出21株酵母菌并通過采用對(duì)峙培養(yǎng)，平皿對(duì)扣培養(yǎng)，孢子萌發(fā)法和果實(shí)活體接種篩選出1 株對(duì)葡萄采后灰霉菌具有生防潛力的拮抗酵母菌，旨在為葡萄采后的生物防治提供理論基礎(chǔ)和菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

從王頂?shù)膛l(fā)市場(chǎng)購買大小一致，成熟度8～9成的蘋果(品種紅富士)、葡萄(品種紅提)、梨(蘋果梨)、香蕉(仙人蕉)、石榴(品種黃里石榴)、芒果(小臺(tái)農(nóng)芒)、楊桃(七根松楊桃)，木瓜等無病蟲和機(jī)械傷口的果實(shí)用于酵母菌的分離與篩選。

1.2 供試酵母菌

從供試材料的果皮和果肉分離中分離得到。

1.3 供試灰霉菌

葡萄灰霉菌(BotrytiscinereaPers)：由天津農(nóng)學(xué)院植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.4 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基， PDB培養(yǎng)基，YEPD培養(yǎng)基：采用常規(guī)方法制備。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酵母菌的分離與純化

材料中酵母菌的分離與篩選：分別取不同水果的果皮和果肉5 g，加入50 mL無菌水研磨成漿，然后進(jìn)行梯度稀釋，最后分別用1×10-3，1×10-4，1×10-5進(jìn)行平板涂布，封口膜封口置于28℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，待長出單菌落后及時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基上進(jìn)行純化。

2.2 不同酵母菌的離體抑菌效果測(cè)定

將已經(jīng)配置好的馬鈴薯培養(yǎng)基加熱至融化，加入100 μL的72%鏈霉素(防治細(xì)菌污染),然后倒平板，待平板中的培養(yǎng)基凝固后在培養(yǎng)皿背面劃中線，在中線一側(cè)接入純化好的酵母菌，在中線另一側(cè)接上葡萄灰霉病菌餅，用封口膜密封培養(yǎng)，放入培養(yǎng)箱中進(jìn)行平皿對(duì)峙培養(yǎng)，重復(fù)3次，并以無菌水作為對(duì)照，48 h后，測(cè)量葡萄灰霉菌菌落的長直徑和短直徑，通過公式計(jì)算抑制率。

抑制率=(處理皿菌落長直徑-處理皿菌落短直徑)/處理皿菌落長直徑×100%

2.3 不同酵母菌的產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效果測(cè)定

采用雙皿對(duì)扣法測(cè)定不同酵母菌對(duì)葡萄灰霉病抑菌效果測(cè)定。向滅好菌的培養(yǎng)皿底加入15 mL的培養(yǎng)基，在一個(gè)培養(yǎng)皿底中接入酵母菌，在另一個(gè)培養(yǎng)皿底中央接入葡萄灰霉病菌餅，然后將接有灰霉病菌餅的平板和接入酵母菌的平板對(duì)扣，酵母菌在下，菌餅在上，用封口膜密封，每一個(gè)處理重復(fù)3次，放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在對(duì)照組中，將涂了無菌水的平板和接入菌病的平板對(duì)扣，72 h后，測(cè)量葡萄灰霉病菌餅的直徑。測(cè)量方法：接種72 h后測(cè)量菌餅直徑，測(cè)量完畢之后利用公式計(jì)算出各種酵母菌對(duì)葡萄灰霉病的抑制率。

抑制率=(對(duì)照皿菌落直徑-處理皿菌落直徑)/對(duì)照皿菌落直徑×100%

2.4 數(shù)據(jù)處理

計(jì)算所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均值，用SPSS Statistics處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同材料中酵母菌分離純化結(jié)果及抑菌效果初篩

通過對(duì)各種水果食材中酵母菌的分離得到21株酵母菌并編號(hào)，并對(duì)其抑制效果進(jìn)行測(cè)定(見表1)：其中以下10株酵母菌具有明顯的抑菌效果：L-4，PG-2，SL-1，YT-1，MuG-1，MaG-2，XJ-1， HJ，NN，TZ-1，其抑制效果均超過50.00%，并且各處理之間差異顯著(p<0.05)，其中菌株SL-1抑菌效果最顯著，達(dá)到77.26%，顯著高于其它處理。

表1 初步篩選純化后的酵母菌

3.2 不同酵母菌對(duì)葡萄灰霉菌生長的影響

對(duì)初篩得到的10株酵母菌進(jìn)行復(fù)篩。結(jié)果見表2(處理5 d后結(jié)果)，10株酵母菌對(duì)葡萄灰霉菌均有一定的抑制作用。但是對(duì)草莓灰霉菌抑制效果超過50%的5株，分別為：SL-1、XJ-1、 L-4、HJ 和MaG-2五株酵母菌，其中SL-1和L-4的抑制效果最顯著，分別為66.04%和63.63%，顯著高于其它幾個(gè)處理(p<0.05)其次酵母菌株MaG-2的抑菌效果也比較顯著，達(dá)到了60.62%；顯著低于菌株SL-1和L-4的抑菌效果(p>0.05)，顯著高于其余處理(p<0.05)。由此可以看出，從不同材料上得到的酵母菌，抑菌效果差異還是比較大。所以，從更多材料上來分離和篩選有拮抗?jié)摿Φ慕湍妇瞧渌黜?xiàng)研究和應(yīng)用的基礎(chǔ)。

表2 不同酵母菌對(duì)葡萄灰霉菌抑制率測(cè)定

3.3 不同酵母菌菌株產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)葡萄灰霉菌生長的影響

由于酵母菌還可以產(chǎn)生具有揮發(fā)性的物質(zhì)[10]，因此本研究專門對(duì)篩選出既有較好抑制效果的8株酵母菌進(jìn)行了揮發(fā)性物質(zhì)抑菌效果測(cè)定，結(jié)果見表3。

表3 酵母菌產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)葡萄灰霉菌生長的影響

從表3可以看出：10株酵母菌株均可以產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)且對(duì)葡萄灰霉菌有不同程度的抑制效果。其中酵母菌株SL-1和PG-2對(duì)葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，達(dá)到71.56%和68.80%，與其它處理相比，差異顯著(p<0.05)。其次為酵母菌菌株XJ-1，對(duì)葡萄灰霉菌的抑制率也達(dá)到了61.40%。由此可以推測(cè)從不同材料上分離得到的酵母菌株均可產(chǎn)生具有抑菌作用的揮發(fā)性物質(zhì)，但是抑制作用差異比較大，這可能不同食材營養(yǎng)物質(zhì)或者生長環(huán)境不同導(dǎo)致在其上生長繁殖的酵母菌株也有所不同，因而產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和數(shù)量也會(huì)有較大的差異。

4 結(jié)論與討論

在本研究中，通過對(duì)峙培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)酵母菌株SL-1和L-4的對(duì)葡萄灰霉菌菌絲體的抑制效果最顯著，分別為66.04%和63.63%；從不同酵母菌菌株產(chǎn)揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)葡萄灰霉菌生長的影響的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)酵母菌株SL-1和PG-2對(duì)葡萄灰霉菌的抑制效果最佳，達(dá)到71.56%和68.80%，綜合兩項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論酵母菌株酵母菌株SL-1和PG-2對(duì)葡萄采后灰霉菌具有良好的抑制效果，其中以酵母菌株SL-1效果最顯著，其次為酵母菌株P(guān)G-2。所以，對(duì)這兩株酵母菌需要進(jìn)行更深入的研究，例如對(duì)生防酵母菌進(jìn)行鑒定，對(duì)其生防機(jī)理進(jìn)行深入研究，對(duì)其防治效果進(jìn)行研究等一系列研究需要開展，通過深入研究有望進(jìn)一步研究開發(fā)成新型生防酵母菌用于葡萄及其它果蔬采后病害的生物防治。