利用UHPLC-ESI-MS/MS法測定川陳皮與其混偽品中的黃酮類成分

李峰慶，王 福,，楊放晴，陳仕偉，熊素琴，陳鴻平，劉友平*，李小川*

1成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中藥標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點實驗室，成都 611137；2南充市食品藥品檢驗所，南充637000

蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的成熟干燥果皮為中藥橘皮，又稱陳皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有理氣健脾、燥濕化痰之效[1]，是歷代醫(yī)家常用的一味理氣藥，在臨床與成藥生產(chǎn)中都有較廣泛的使用。我國柑橘分布廣泛，變種甚多，故認為凡源于蕓香科植物橘及其栽培變種的成熟果皮都能做陳皮入藥，但隨著柑橘育種技術(shù)的發(fā)展和實踐，柑橘新品種的推出逐漸打破了原有的品種分布格局。如以四川“大紅袍”為代表的道地藥材來源植物，其栽培面積逐漸被不知火柑橘等新品種所超越或取代[2-3]，道地藥材川陳皮也隨之減少，藥材市場川陳皮常見混偽品多見寬皮柑橘類植物的果皮[4](以不知火橘皮及其早晚熟變種為主)，因此，有效區(qū)分川陳皮與常見混偽品對保證川陳皮品質(zhì)、臨床療效以及資源保護具有重要意義。

不同栽培品種來源陳皮藥材的區(qū)分一直較為困難，尤其混偽品切絲后與正品藥材真?zhèn)坞y分。本課題嘗試采用DNA條形碼技術(shù)區(qū)分正品陳皮與其混偽品，結(jié)果表明條形碼通用序列ITS2序列不能較好地區(qū)分[5]。液相色譜或其聯(lián)用質(zhì)譜技術(shù)為常見文獻報道中藥材化學(xué)成分分析的方法，但色譜分析法依賴標(biāo)準(zhǔn)品，對中藥材中含量較低的化學(xué)成分難以檢測，定量分析化學(xué)種類有限，難以反映其化學(xué)成分的代謝譜[6]。近年來，隨著基于UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)的發(fā)展，為中藥材化學(xué)成分的全面分析提供了一種可靠的方法。Qin等[7]提出了基于植物代謝組學(xué)技術(shù)的中藥材質(zhì)量評控思路，認為代謝組學(xué)技術(shù)可以用于中藥的區(qū)分或差異性評價。黃酮類成分為陳皮中主要起抗氧化、抗腫瘤、抗炎、心血管保護、神經(jīng)保護等活性的一大類有效成分，又細分為以川陳皮素為代表的多甲氧基黃酮類及以橙皮苷為主的二氫黃酮苷類，本課題組前期研究陳皮“陳久者良”產(chǎn)生機制就是以多甲氧基黃酮為主要指標(biāo)成分。

因此，本文以道地藥材川陳皮及其常見混偽品不知火橘皮為研究對象，利用UHPLC-ESI-MS/MS法測定陳皮有效成分黃酮類成分。首先基于多渠道公共質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫對黃酮類化合物進行定性鑒定分析，明確川陳皮與其混偽品的黃酮類成分代謝譜；其次采用PCA與OPLS-DA分析法對其黃酮代謝物進行分類，探尋基于代謝物類別差異進行鑒別的方法；然后通過火山圖分析明確差異化合物上調(diào)下調(diào)，經(jīng)過KEGG分析得知黃酮類化合物的代謝通路差異；最后利用基于差異化合物類別及相對含量尋找川陳皮與其混偽品特征性成分與標(biāo)志物。其研究結(jié)果將建立一種高效區(qū)別川陳皮與其混偽品的方法，并為柑橘其他品種的區(qū)分與鑒定提供參考。

1 材料

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC，Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A，Tandem mass spectrometry，MS/MS，Applied Biosystems 6500 QTRAP)；色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18:1.8 μm，2.1mm×100mm)；ME04E電子分析天平(捷久計量衡器(上海)有限公司)；多樣品組織研磨儀 CEBO-24(上海測博)；SC-3610低速離心機(安徽中科中佳科協(xié)儀器有限公司)；移液槍(德國Eppendorf公司)。乙腈(美國Fisher chemical，色譜純)；哇哈哈純凈水；甲酸(美國，MREDA Technology Inc)；甲醇、乙醇(北京化工廠，分析純)。

實驗所用樣品采集于四川省南充市營山縣青山村等地，采集時間為2018年12月7號，采集柑橘成熟果實后，現(xiàn)場剝皮，返回實驗室晾干，編號標(biāo)記后，保存于-80 ℃冰箱。新鮮樣品由成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴鑄云教授鑒定，分別為蕓香科植物橘C.reticulata‘Dahongpao’與C.reticulata‘Buzhihuo’的果皮。樣品信息如下表1。

表1 樣品信息

2 實驗方法

2.1 樣品制備

將樣品置于真空冷凍機干燥，取0.5 g利用研磨儀(Retsch)研磨(30 Hz，1.5 min)至粉狀，稱取100 mg的粉末，與1.0 mL 70%的甲醇水溶液混合均勻，置于4 ℃的冰箱過夜，期間3次渦旋，提高提取率，離心(轉(zhuǎn)速10 000 rpm，10 min)后，吸取上清，用0.22 μm微孔濾膜過濾樣品，并保存于進樣瓶中，用于UHPLC-ESI-MS/MS分析。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：以0.04%乙酸水(A)-0.04%乙酸乙腈(B)為流動相，梯度洗脫(0～11.0 min，95%→5%A；11.0～12.0 min，5%A；12.0～12.1 min，5%→95%A；12.1～15.0 min，95%A)；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL。

質(zhì)譜參數(shù)：電噴霧離子源溫度500 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣壓25 psi，碰撞誘導(dǎo)電離設(shè)置參數(shù)“高”，去簇電壓與碰撞能的設(shè)置參考文獻[8]。

2.3 代謝物定性定量及數(shù)據(jù)分析

基于代謝物信息公共數(shù)據(jù)庫對質(zhì)譜檢測的一級譜、二級譜數(shù)據(jù)進行定性分析。其中部分物質(zhì)定性，分析時去除了同位素信號，含鉀離子、鈉離子、氨基離子的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。代謝物結(jié)構(gòu)解析參考MassBank、KNSPSAcK、HMDB、MoToDB、METLIN等已有的公共數(shù)據(jù)庫[9-10]。獲得不同樣本的代謝物質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，用MultiaQuant軟件對所有物質(zhì)質(zhì)譜峰進行峰面積積分，并對其中同一代謝物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進行積分校正[11]。如圖1為隨機抽取的代謝物在不同樣本中的定量分析積分校正結(jié)果，橫坐標(biāo)為代謝物檢測的保留時間(min)，縱坐標(biāo)為某代謝物離子檢測的離子流強度(cps)。

圖1 代謝物積分校正圖Fig.1 Metabolite integral correction chart

2.4 樣本質(zhì)控分析

質(zhì)控樣本(QC)由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每10個檢測分析樣本中插入一個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程中的重復(fù)性。通過對不同質(zhì)控樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖(圖2)進行重疊展示分析，可以判斷代謝物提取和檢測的重復(fù)性，即技術(shù)重復(fù)。儀器的高穩(wěn)定性為數(shù)據(jù)的重復(fù)性和可靠性提供了保障。

圖2 QC樣本質(zhì)譜檢測TIC重疊圖Fig.2 TIC overlapping map detected by QC sample mass spectrometry

3 結(jié)果與分析

3.1 黃酮類化合物的鑒定結(jié)果

經(jīng)過分析本文共鑒定出228種黃酮類化合物，包括多酚12種、花青素21種、黃酮類132種、黃酮醇36種、黃烷酮20種、異黃酮7種，其中川陳皮中鑒定出特有化合物15種(表3)，混偽品中鑒定出特有化合物16種(表4)，具有明顯藥理活性的化合物組合可以明顯作為區(qū)分二者的標(biāo)志化合物。

表4 混偽品中特有的黃酮類化合物

續(xù)表4(Continued Tab.4)

3.2 主成分分析(PCA)與正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)結(jié)果

主成分分析是一種將變量重新組合成一組新的相互無關(guān)的幾個綜合變量[12]，同時根據(jù)實際需要從中可以取出幾個較少的總和變量盡可能多地反映原來變量的信息的方法。本文通過該分析方法將黃酮類化合物的差異通過降維處理以直觀反映樣本之間的代謝物差異情況。圖3a中可以看出，主成分PC1與PC2的占比分別達到了63.10%和20.77%，積累貢獻率達到了83.87%。川陳皮與其混偽品分別聚為一類，證實了實驗的可靠性與重復(fù)性。

正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)被廣泛用于代謝組數(shù)據(jù)的分析，由于其分析方法可以最大化組間差異常被用于差異代謝物的篩選[13]。在OPLS-DA分析中，Q2是一個重要的參數(shù)，若數(shù)值大于0.9，則可以反映該模型的可靠性與穩(wěn)定性。圖3b中可以看出，Q2為0.998，證實該模型可以用以下一步的差異代謝物分析。

圖3 川陳皮與其混偽品代謝物的PCA(a)與OPLS-DA(b)分析。Fig.3 PCA(a) and OPLS-DA(b) analysis of metabolites of CCRP and its adulterant

3.3 差異代謝物的篩選、注釋與富集

本文結(jié)合單變量分析的差異倍數(shù)值(fold change)與多變量分析OPLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in project，VIP)數(shù)值進行樣品之間的差異代謝物篩選。篩選標(biāo)準(zhǔn)為選取fold change≥2或fold change≤0.5和VIP≥1的差異代謝物，即代謝物在組間差異為2倍以上或0.5倍以下以及VIP≥1，則認為差異顯著[14]，由此共計篩選出52種差異代謝物。根據(jù)差異代謝物含量作聚類熱圖(圖4)，由圖可以清晰看出川陳皮樣品與其混偽品間成分差異明顯，而組內(nèi)樣品成分差異較小。

圖4 川陳皮與其混偽品的代謝物聚類熱圖Fig.4 Metabolite clustering heatmap of CCRP and its adulterant

另以代謝物在樣品中定量差異倍數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，VIP值為縱坐標(biāo)繪制火山圖差異代謝火山圖(圖5c)，橫坐標(biāo)越大，則表達量在兩類樣品間表達量倍數(shù)差異越大；縱坐標(biāo)越大，差異表達越明顯。從圖5c中可以看出，上調(diào)化合物31種，下調(diào)化合物21種。另由2.1分析結(jié)果可知，川陳皮中鑒定出特有化合物15種，混偽品中鑒定出特有化合物16種，因此，可以判斷川陳皮與其混偽品中的黃酮類化合物有顯著差異，建議在臨床使用上區(qū)別使用。

圖5 川陳皮與其混偽品差異代謝物的KEGG分類圖(a)、KEGG富集圖(b)及火山圖(c)Fig.5 KEGG classification(a),statistics of KEGG enrichment(b) and Volcanic plots(c) of differential metabolites of CCRP and its adulterant

川陳皮與混偽品之間差異代謝物經(jīng)過數(shù)據(jù)庫KEGG注釋。KEGG分類與富集分析結(jié)果顯示(圖5a和5b)，差異代謝物主要參與花青素生物合成、黃酮與黃酮醇生物合成、黃烷酮生物合成和黃酮類生物合成。

4 討論

本文基于UHPLC-ESI-MS/MS技術(shù)的代謝組學(xué)方法對川陳皮與其混偽品中的黃酮類化合物進行分析。結(jié)果表明，共鑒定出228種黃酮類化合物，包括多酚12種、花青素21種、黃酮類132種、黃酮醇36種、黃烷酮20種、異黃酮7種。川陳皮與混偽品所含黃酮類化合物差異較大，PCA分析、OPLS-DA分析與聚類分析均可顯著區(qū)別。另共篩選出52種差異代謝物，其中川陳皮中鑒定出特有化合物15種，混偽品中鑒定出特有化合物16種。這些特征化合物均可作為鑒別川陳皮與混偽品的特征性成分。如川陳皮中特有成分姜黃素、根皮素類、花青素類及其苷類等化合物在臨床上具有顯著抗氧化、抗腫瘤、降血脂等功效，對其質(zhì)量控制以及品質(zhì)評價均有重要參考價值。

中國2015年版本《中國藥典》陳皮項下規(guī)定，橘及其栽培變種均可作為陳皮藥材來源品種。本文研究結(jié)果表明，不知火橘皮與川陳皮中的黃酮類化合物具有顯著差異。進過文獻查閱得知，不知火柑橘為現(xiàn)代柑橘雜交品種，是農(nóng)學(xué)科學(xué)家為迎合消費者追求的舒服口感以及果農(nóng)追求的經(jīng)濟價值高、抗病、高產(chǎn)需求而選育出來的雜交品種，物種基因組可能含有其他橙、柚品種的基因[15]。設(shè)想如橙或柚基于滲入橘雜交品種中，在改變橘甜度、口感、高產(chǎn)、抗病等農(nóng)藝性狀的時候，其藥用部位有效成分、藥效變異與傳遞是否等效值得深入研究。因此，建議加強對不同來源品種陳皮藥材在基因、化學(xué)、藥理作用等各方面變異值大小的評價研究，以篩選出適合臨床使用的品種，確保臨床用藥的有效、安全與穩(wěn)定。