基于網絡藥理學的血必凈注射液干預細胞因子風暴輔助治療重癥新型冠狀病毒肺炎的潛在機制研究

吉米麗汗·司馬依，買買提明·努爾買買提，艾尼瓦爾·吾買爾，買爾旦·玉蘇甫，卡依賽爾·阿布都肉蘇力，木哈待斯·努爾，努麗比亞·買合木提，周文婷*

1新疆醫科大學藥學院；2新疆醫科大學維吾爾醫學院，烏魯木齊 830011

2019年12月，在武漢市暴發新型冠狀病毒肺炎疫情。2020年2月世界衛生組織(WHO)宣布，新型冠狀病毒命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2)，由這一病毒導致的疾病的正式名稱為COVID-19(corona virus disease 2019)。截止到2020年3月25日國內外已有33萬多名確診病例。患者有嚴重的急性呼吸系統(SARI)癥狀，包括發燒、呼吸困難、乏力、咳嗽和肺炎等[1]。研究表明，COVID-19 患者炎癥反應增強，重癥患者相比輕癥患者，血漿多種促炎因子表達水平明顯更高，認為“細胞因子風暴”是COVID-19主要的致病機制之一[2]。細胞因子風暴(cytokine storm)指的是高濃度的不受控制的細胞因子釋放，是引起急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭的重要因素。

從疫情發生后，國家衛生健康委聯合國家中醫藥管理局在《關于印發新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)的通知》中要求加強中西醫結合，并推薦了多個中成藥在診治過程中使用，建立中西醫聯合會診制度，盡量早期進行中醫藥治療，以共同促進COVID-19臨床療效的提高。其中血必凈注射液為《診療方案》中推薦使用的中成藥，用于COVID-19重型、危重型患者治療。血必凈注射液(Xuebijing injection，XBJI)是純中藥制劑，由紅花、赤芍、川芎、丹參和當歸等5味中藥提取制成，在防治細胞因子風暴方面具有一定的科學依據和臨床基礎[3]。研究報道[4]，對20例重癥肺炎合并膿毒癥患者進行研究，結果顯示應用血必凈注射液治療效果確切。還有研究報道[5]，對126例老年重癥肺炎合并呼吸衰竭患者進行研究，發現在常規治療基礎上聯合使用血必凈注射液能顯著改善患者肺部氧合功能，提高臨床療效。因此，本文運用網絡藥理學方法分析血必凈注射液干預細胞因子風暴密切相關的信號通路和潛在靶點，從而防治COVID-19，提高中醫藥治療重癥COVID-19患者的參與度提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 血必凈注射液活性成的收集及篩選

XBJI的5味草藥通過TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，TCMID數據庫(http://bionet.ncpid.org/)和BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)進行成分的收集。收集所得的所有化學成分通過TCMSP分析平臺的藥物口服生物利用度(oral bioavailability,OB)和類藥性(drug-likeness,DL)ADME參數的限制對其中可能的活性成分進行篩選、做進一步分析。DL是與良好的臨床療效相關聯的物理化學性質及生物學特性。DL越大，則成藥性越高。Lipinski指出，類藥化合物系具有在人體藥代藥動學過程中表現為較好的ADME特性和安全性，是綜合了藥代動力學性質與藥物的安全性的指標[6]。對于通過口服途徑給藥的藥物，OB 是最重要的藥代動力學參數之一，是衡量藥物進入人體循環系統有效性的一個重要指標。良好的口服生物利用度是化合物具有藥理活性的基本前提之一。以系統藥理學方法來分析傳統中醫藥時，OB≥30和DL≥0.18為篩選生物活性成分的標準[7]。

1.2 活性成分對應的作用靶點的預測及篩選

首先，通過TCMSP數據庫收集活性成分對應的靶點。然后，將所有靶點通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)以“homo sapiens”(人屬)為關鍵詞進行基因-蛋白名稱轉化，即將全部蛋白名稱轉換為基因名稱。

1.3 細胞因子風暴相關靶點的篩選及其與血必凈共有潛在靶點的篩選

利用 “cytokine storm” 作為關鍵詞，對CTD數據庫(http://ctdbase.org/)進行已知的細胞因子風暴相關靶點的檢索及篩選，并刪除檢索結果中重復的靶點。此靶點與XBJI活性成分的靶點映射后得到共有的潛在靶點。通過Cytoscape3.7.1軟件(https://cytoscape.org)構建草藥-潛在成分-潛在靶點網絡圖(herb-potential compound-potential target，HB-pC-pT network)。

1.4 GO基因功能和KEGG通路分析

以上得到的XBJI干預細胞因子風暴的潛在靶點通過DAVID6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因功能(GO)和信號通路分析(KEGG)。

2 結果

2.1 血必凈注射液活性成分分子庫篩選及其靶點的預測

XBJI的5味草藥通過TCMSP，TCMID和BATMAN-TCM數據庫共收集到925個成分，其中紅花201個、赤芍138個、川芎192、丹參218個和當歸176個(表1)。并將成分通過OB≥30和DL≥0.18篩選，并刪除重復的成分后得到71個活性成分，XBJI活性成分ADME的基本信息見表2。以上得到71個活性成分通過TCMSP數據庫篩選其對應的1 132個相關靶點，將靶點通過Uniprot數據庫進行基因名稱-蛋白名稱轉換，并刪除重復的靶點名稱后得到241個作用靶點。

表1 XBJI 5味草藥的總成分

表2 XBJI活性成分的ADME篩選

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

2.2 細胞因子風暴相關靶點的篩選及其與血必凈注射液共有潛在靶點的篩選結果

通過CTD數據庫以“cytokine storm” 作為關鍵詞篩選得到與細胞因子風暴相關的83個靶點。此靶點與241個XBJI活性成分的靶點進行映射得到27個共有的潛在靶點(圖1)。從Cytoscape3.7.1軟件構建的成分-靶點網絡中，得到作用于27個潛在靶點的17個潛在成分。并構建5個草藥-17個潛在成分-27個潛在靶點網絡圖(HB-pC-pT network)，如圖2所示。該網絡由49個節點(5個草藥、17個潛在成分和27個潛在靶點)和100個邊緣組成。HB(綠色八角形)、pC(黃色四角形)和pT(紅色圓形)之間的邊緣代表相互作用。一個節點度(degree)代表在蛋白相互作用網絡中與該節點直接相互作用的節點的數目。節點的大小與度數成正比。節點的度越大則其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強[8]。從潛在成分的角度分析，其中degree排在前5位的有槲皮素(degree=25)、木犀草素(degree=13)、山奈酚(degree=11)、β-胡蘿卜素(degree=8)和黃芩素(degree=7)。從潛在靶點的角度分析，degree≥5的靶點分別為CASP3、RELA、GSK3B、IL-6、IL-1β、TNF、IL-10。結果表明，以上潛在成分及其潛在靶點節點度越大則其參與的生物功能越多，其生物學重要性越強。以上結果可以看出來，血必凈注射液中存在一個成分與多個靶點作用，同時也存在不同成分共同作用于同一個靶點的現象，這體現了中藥多成分與多靶點之間共同作用的機制。草藥中丹參與活性成分的關聯網絡最多(degree=9)，是血必凈注射液的主藥。近期研究報道，丹參為活血化瘀的代表藥，其抗炎機制符合新冠病毒引發細胞因子風暴的病理特點，使用丹參進行組方將有利于抑制新冠肺炎炎癥發展并改善肺部微循環[9]。

圖1 血必凈注射液和細胞因子風暴共有潛在靶點韋恩圖Fig.1 The venn diagram of cytokine storm and XBJI common potential targets

圖2 草藥-潛在成分-潛在靶點網絡圖Fig.2 HB-pC-pT network

2.4 GO基因功能和KEGG通路分析結果

為了系統地解釋XBJI輔助治療COVID-19的作用機制，將27個潛在靶點通過DAVID數據庫進行GO基因功能和KEGG信號通路分析結果顯示，作用靶點涉及到214條目生物過程(biological process，BP)、32條目分子功能(molecular function，MF)、16條目細胞組分(cellular component，CC)(見圖3)以及86條KEGG信號通路。KEGG信號通路按照FDR(錯誤發現率，FDR≤0.01)大小進一步篩選，FDR表示在富集分析中越小，就代表富集顯著程度就越高。以FDR≤0.01為標準篩選得到8條主要信號通路以及參與的21個潛在靶點，如圖4所示。其中FDR最小的通路是TNF信號通路。

圖3 血必凈注射液的GO基因功能分析Fig.3 GO analysis of the target of XBJI active components

圖4 血必凈注射液的信號通路分析Fig.4 KEGG pathway analysis of the target of XBJI active components

3 討論

2019年12月以來，細胞因子風暴再次進入了人們的視線，其發病機制復雜、疾病進展迅速、死亡率較高。細胞因子風暴起源于抗原刺激，在正常情況下，機體通過“正反饋”調節對抗外界來的病原體，抗原信號傳遞給免疫系統的信號減弱，細胞因子釋放就會開始減少，從而形成“負反饋”(負循環)調節[10]。而細胞因子風暴的本質是免疫紊亂，當兇猛病毒入侵機體時，比如此時正在暴虐的SARS-CoV-2感染等，因免疫調控網絡失衡、負反饋的缺失和正反饋的不斷自我放大，人體免疫系統會釋放大量的細胞因子，這使細胞因子信號變大。細胞因子風暴的后果是組織損傷，即細胞因子信號的變大，可能會導致機體免疫調控網絡失衡，引起細胞因子風暴而導致疾病惡化[11]。對以上后果的防治應以早期干預為主，中醫藥在此方面有著獨到的優勢。

目前，對于SARS-CoV-2 感染及其引起的細胞因子風暴還沒有特效藥物。《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案(試行第六版)》指出，對于重型、危重型病例的治療，主要有呼吸支持、循環支持、康復者血漿治療，必要時酌情使用糖皮質激素，可使用血必凈注射液和腸道微生態調節劑。中醫藥具有多靶點效應和整體調理作用，部分組分具備一定程度的抗菌抗病毒效果，其抗病毒的研究要注重整體效應，不僅單從某一個指標來解釋，更加考慮各指標或因子間的相互作用，以整體調節作用有助于從源頭阻止細胞因子風暴的產生[12]。研究報道[13]，血必凈注射液對甲型H1N1病毒感染重癥肺炎小鼠的臟器保護作用。此外，用于治療老年重癥肺部感染可明顯改善患者高凝狀態，降低炎癥因子水平，調節免疫功能，有效保護患者的肺臟功能和組織結構，以減輕肺損傷，可糾正機體的“過度免疫”，從而有利于控制疾病向“細胞因子風暴”發展[14]。

細胞因子包括促炎細胞因子如IL-6、IL-2、IL-8、IL-1β、TNF-α和抗炎細胞因子如IL-4、IL-11、IL-13、IL-10、IL-1。這兩者之間平衡是維持機體的正常免疫功能和抵抗疾病的關鍵因子。從HB-pC-pT網絡結果可以看出來，IL-6、IL-1β和TNF-α促炎細胞因子以及IL-10抗炎細胞因子等靶點在血必凈注射液干預細胞因子風暴方面生物學功能比較強。據《柳葉刀》論文報道，在早期的99個病例中，17個COVID-19患者出現了由細胞因子風暴造成的肺毛細血管內皮細胞以及肺泡上皮細胞的彌漫性損傷而導致ARDS的發生，病情短期內出現惡化，伴隨呼吸衰竭并最終多器官衰竭致死，共有11例死亡[15]，臨床發現大量升高的細胞因子主要為IL-6、TNF-α、IFN-γ等[16]。有學者發現，SARS-CoV-2的患者也有大量的IL-Iβ、INF-γ、IP-10和MCP-1。SARS-CoV-2感染同時也導致了抑制炎癥的IL-4和 IL-10的分泌增加[17]。研究報道，血必凈注射液通過下調IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子以及上調IL-10抗炎細胞因子而發揮明顯的抗炎作用，并通過影響機體免疫細胞的數量來調節免疫功能，可有效保護患者的肺臟功能和組織結構，以減輕肺損傷[18,19]。又研究報道，槲皮素和芍藥苷會下調IL-6、IL-1β和TNF以及上調IL-10而發揮抗炎作用[20-22]。而本研究結果表明，血必凈注射液活性成分中槲皮素和芍藥苷主要作用于IL-6、IL-1β、TNF和IL-10，這與前期研究報道相符合。

KEGG信號通路結果表明，TNF信號通路的FDR最小，說明TNF信號通路是血必凈注射液干預細胞因子風暴的主要信號通路，其次是T細胞信號通路。研究報道，血必凈注射液能下調對T細胞增殖和分泌功能的抑制效應[23]。由此可見，血必凈注射液主要通過上調調節性T細胞、促進IL-10分泌、下調TNF-α、IL-6、IL-1β調節機體免疫功能，糾正機體的“過度免疫”，有利于控制疾病向“細胞因子風暴”發展。本文研究血必凈注射液與細胞因子風暴的關聯網絡，探討其輔助治療重癥COVID-19相關的作用路徑和潛在的機制靶點，為臨床治療提供有價值的用藥指導。