基于網絡藥理學聯合分子對接對逍遙散干預原發性肝癌的作用機制研究

商志浩，潘成鎮，馬月輝，謝卓容，韋紫怡，羅偉生，彭 岳，岑妍慧,2*

1廣西中醫藥大學；2廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧 530000

原發性肝癌(HCC)是臨床常見的消化系統惡性腫瘤，有流行廣、起病緩慢、出現癥狀后疾病進展迅速、侵襲性強、病死率高[1]的特點。據統計，肝癌死亡率在惡性腫瘤城市死亡率中居于第二位，僅次于肺癌；農村居于第二位，僅次于胃癌。目前我國每年約有11萬人死于肝癌，并且我國的肝癌發病率是全球最高，肝癌發病人數占全球的50%以上[2]，對我國人民的身體健康造成嚴重威脅。肝癌可發生于任何年齡，其中以35～55歲最多，男女之比約為1∶1～4∶1。早期切除是療效較好的治療方法之一，但大多數肝癌患者確診時已屬晚期，多數已錯過手術時機，所能采用的現代綜合治療方法常被限制在放化療和免疫治療上，而放化療對本病的治療毒副反應大，適應證少，療效往往難以令人滿意。目前，中西醫結合治療是本病的主要治療手段之一。

逍遙散，中醫方劑名。出自《太平惠民和劑局方》卷九。逍遙散為和解劑，具有疏肝解郁，養血健脾之功效，主治肝郁血虛脾弱證。目前，醫療工作者做了一定量的關于逍遙散治療原發性肝癌及其并發癥的臨床研究，如Xiong等[3]選取了72例原發性肝癌患者，將其分成三組分別使用西藥化療加苦參注射液、西藥單純化療、西藥化療加逍遙散加減進行治療，結果用西藥化療加逍遙散治療組相較于其他對照組取得了較好療效，根據病人的各方面數據也顯示逍遙散具有改善原發性肝癌患者的肝功能、生活質量、外周血白細胞等作用。但是由于逍遙散成分復雜多樣，其治療原發性肝癌的作用機制目前尚未有明確研究報道。

網絡藥理學是近年來新興的的一門學科，融合了系統生物學、多向藥理學、計算生物學、網絡分析等多學科的技術和內容，將生物學網絡與藥物作用網絡整合，探究疾病及藥物的相互作用機理，與復雜疾病的治療理念相吻合[4]，已被廣泛用于中藥潛在活性成分和作用靶點的預測及中藥作用機制的闡述。本研究基于網絡藥理學手段，結合文獻調研、數據挖掘、統計推斷、生物信息學等方法，構建逍遙散與原發性肝癌相互作用的藥物與生物分子復雜關系網絡，發掘藥物作用靶點及藥物與內源性蛋白及生物通路的作用關系，從而合理預測和科學推斷有效物質成分的作用靶點及其調控的生物學過程和機制，力求更全面深入揭示逍遙散的藥效物質基礎和治療原發性肝癌的療效機制。

1 材料與方法

1.1 相關數據庫

使用GEO數據庫提取并分析得出HCC的差異基因；TCMSP數據庫用于獲取逍遙散中的有效成分及作用靶點；對應逍遙散與HCC的交集基因，綜合BioGRID、BIND、MINT、HPRD、DIP、GRID數據庫分析得出PPI蛋白互作網絡；利用David數據庫中的數據進行GO和KEGG富集分析；PDB數據庫用于下載關鍵蛋白的3D結構。

1.2 基因芯片篩選

以“liver cancer normal”作為檢索詞，從GEO數據庫篩選出同時含有肝癌組織和正常組織的人源基因芯片，并下載基因芯片的matrix文件，文件編號：GSE118916，以獲取樣本信息。

1.3 差異基因(DEGS)的篩選與處理

使用GEO2R在線分析工具,從基因芯片中篩選肝癌組織與正常組織的差異基因。并以adj.P.Val<0.05，2Ilog2(FC)I>1為條件，從中篩選出肝癌組織中較正常組織顯著上調、下調的差異基因，借助MEV4.9.0(Multi Experiment Viewer)繪制基因聚類熱圖及火山圖。

1.4 逍遙散的活性成分及靶點挖掘

中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(TCMSP)是一個獨特的中草藥系統藥理學平臺，它能捕捉藥物、靶標和疾病之間的關系，能夠從整體層面研究藥物靶標網絡和疾病網絡，揭示中藥性質與作用機制[5-7]。從TCMSP在線平臺(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)獲取逍遙散(柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、甘草)中各味中藥的化學成分，根據口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)篩選出符合條件的候選活性成分及其對應靶點，將OB≥30%，DL≥0.18設為篩選條件[8]。借助美國國家生物技術信息中心數據庫(NCBI)和Uniprot數據庫，將物種限定為“人”，將靶點轉換成對應的基因。

1.5 “中藥化學成分-作用靶點”網絡的構建和分析

將中藥的預測靶點與HCC相關靶點取交集，所得交集靶點即為逍遙散作用于HCC的預測靶點。構建中藥化學成分-作用靶點網絡，通過Cytoscape3.7.2軟件中的“Network Analyzer”功能對中藥化學成分-作用靶點網絡進行分析，節點(node)代表逍遙散中所含藥物化學成分與潛在作用靶點；邊(edge)展現了中藥活性成分和其作用靶點之間的聯系，根據活性成分與靶點連接情況篩選出逍遙散作用于HCC的關鍵成分。

1.6 蛋白互作網絡構建和關鍵靶點篩選

蛋白質相互作用網絡繪制主要借助Cytoscape3.7.2軟件中的BisoGenet插件，其中BisoGenet由6種蛋白質相互作用關系數據庫構成的，包括Biological General Repository for Interaction Datasets(BioGRID)、Biomolecular Interaction Network Database(BIND)、Molecular Interaction Database(MINT)、Human Protein Reference Database(HPRD)、Database of Interacting Proteins(DIP)和Biological General Repository for Interaction Datasets(GRID)。本研究將上述逍遙散的作用靶點和HCC相關的疾病靶點分別映射到蛋白質相互作用關系網絡中，借助 BisoGenet 插件對2個蛋白質相互作用關系網絡進行繪制，同時利用 cytoscape3.7.2合并2個蛋白質相互作用關系網絡，并對交集網絡進行抽取，抽取獲得的交集網絡即為逍遙散治療HCC的直接和間接靶點調控網絡。

結合相關文獻，并借助自由度、緊密度、特征向量中心性、中心中介性、網絡中心性和局部邊連通性等指標，采用網絡拓撲分析插件CytoNCA進行進一步的蛋白互作網絡拓撲結構分析，篩選出邊數大于250的網絡節點，即“Big hubs”；然后篩選網絡中介數中心度大于61的節點，即為蛋白互作網絡中的關鍵基因[9]。上述獲得的相關成分及靶點則有可能是直接、間接調控這些節點，發揮治療HCC的作用。

1.7 GO基因功能富集分析

通過R語言中的“DOSE”、“clusterProfiler”、“enrichplot”R包對交集基因進行GO功能富集分析，進一步闡釋中藥活性成分的靶點蛋白在基因功能中的作用。

1.8 KEGG通路富集分析

通過R語言中的“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”、“enrichplot”、“ggplot2”R包對交集基因進行KEGG功能富集分析，進一步闡釋中藥活性成分的靶點蛋白在通路功能中的作用。

1.9 逍遙散核心成分與關鍵靶基因的分子對接驗證

先用ChemOffice軟件構建活性成分的3D結構保存為mol2格式并使其能量最小化。從PDB數據(https://www.rcsb.org/)下載關鍵蛋白的3D結構PDB格式，運用PyMOL軟件對蛋白質進行去水、加氫等操作，利用AutoDock軟件將活性成分及靶蛋白格式轉換為pdbqt格式，最后運行Vina進行對接。結合能小于0說明配體與受體可以自發結合，目前對于活性分子的靶點篩選尚無統一標準，這里通過對“藥物—HCC”交集靶點與蛋白互作網絡進行分析，篩選出兩者共有且度值最高的兩個蛋白分別與藥物中與之作用的同樣度值最高的兩個分子進行分子對接驗證。

2 結果

2.1 HCC相關差異基因表達分析

通過對GEO芯片數據庫的基因芯片進行挖掘分析，獲取HCC患者肝組織與正常人肝組織的基因表達譜中明顯影響和改變的基因共580個，其中上調基因280個，下調基因413個。差圖1,火山圖見圖2。

圖1 HCC差異基因熱圖Fig.1 The thermogram of HCC differential gene

2.2 化合物有效活性成分篩選

以OB≥30%，DL≥0.18為條件，對TCMSP數據庫進行檢索，得到逍遙散中活性成分2 241個，其中來自柴胡的活性成分347個，來自當歸的活性成分65個，來自白芍的活性成分118個，來自白術的活性成分22個，來自茯苓的活性成分29個，來自甘草的活性成分1 660個。

2.3 逍遙散有效活性成分—HCC網絡構建及分析結果

將2 241個靶點與580個HCC差異基因取交集，得到27個交集基因，對應逍遙散中99個候選活性成分，其中對應甘草化合物77個，柴胡活性成分7個，茯苓活性成分4個，白術活性成分3個，白芍活性成分2個，混合活性成分6個。逍遙散有效活性成分見表1。借助軟件 Cytocsape3.7.2構建中藥活性成分—靶點基因相互作用網絡，網絡中有127個節點(逍遙散活性成分節點100個，靶基因節點27個)和183條邊，見圖3。圖中度值最高的活性成分為槲皮素(quercetin)，其次為山柰酚(kaempferol)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、甘草查爾酮A(licochalcone A)等。這些度值較高的活性成分可能是逍遙散治療HCC的關鍵活性成分。

表1 逍遙散干預HCC的有效分子成分

續表1(Continued Tab.1)

圖3 逍遙散有效活性成分—靶點網絡Fig.3 Xiaoyaosan compound-target network注：綠色橢圓：甘草活性成分；綠色橢圓：白芍活性成分；藍色橢圓：柴胡活性成分；紅色橢圓：白術活性成分；灰色橢圓：逍遙散復合物活性成分；黃色橢圓：茯苓活性成分；粉色三角：靶基因。Note:Green ellipse:Gancao compound;Light green ellipse:Baishao compound;Blue ellipse:Chaihu compound;Red ellipse:Baizhu compound;Gray ellipse:Xiaoyaosan complex compound;Yellow ellipse:Fuling compound;Pink Triangle:Target gene.

2.4 逍遙散治療HCC的蛋白相互作用網絡構建與關鍵靶點篩選

2.4.1 PPI蛋白互作網絡構建

通過蛋白相互作用網絡的構建，本研究發現逍遙散可以與1 375個靶點產生直接或間接作用，而這些靶點與靶點之間的相互聯系多達24 942種。本研究利用蛋白質相互作用網絡，進一步深入分析逍遙散影響HCC發生、發展中的靶點，繪制蛋白質相互作用靶點網絡，為網絡分析和機制的探討提供了可能。

2.4.2 PPI蛋白互作網絡關鍵靶點篩選

本研究使用Bisogenet插件，以DC≥61，BC≥250為條件，對逍遙散調控HCC的蛋白相互作用網絡節點進行拓撲結構分析及關鍵靶點篩選，旨在尋找網絡中關鍵節點，并在網絡中獲得更多節點的傳遞信息和更高的節點信息傳遞效率，充分發揮其在網絡中重要的作用。通過網絡拓撲分析，本研究共發現關鍵節點50個，見表2，篩選策略示意圖見圖4。

圖4 逍遙散干預HCC核心靶點篩選策略示意圖Fig.4 Schematic diagram of Xiaoyaosan’s selection strategy for interfering with HCC core targets

表2 PPI蛋白互作網絡關鍵靶點

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

2.5 GO功能分析結果

27個逍遙散—HCC交集基因影響了271個生物學過程，選取P值排名20的功能信息，圖5～7。圖表顯示逍遙散活性成分主要富集在無機物質細胞反應、細胞激素代謝過程金屬離子反應、類固醇分解過程、伯醇代謝過程等生物過程中，在分子功能方面，主要涉及趨化因子活動、氧化還原酶活性、趨化因子受體結合等，細胞組成主要影響細胞周期蛋白復合物、蛋白激酶全酶復合物、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶復合物等。

圖5 GO富集功能分析柱狀圖(CC富集結果)Fig.5 Histogram of GO enrichment function analysis(CC enrichment results)

圖6 GO富集功能分析柱狀圖(BP富集結果)Fig.6 Histogram of GO enrichment function analysis(BP enrichment results)

圖8 KEGG富集通路氣泡圖Fig.8 Bubble diagram of KEGG enrichment pathway注：圓點越大，富集基因數目越多；圓點顏色越紅，P值越小；逍遙散治療HCC的關鍵靶點參與的通路信息。Note:The larger the dot,the greater the number of enriched genes.The redder the dot,the smaller the P value;Pathway information on the involvement of key targets of Xiaoyaosan in the treatment of HCC.

2.6 KEGG富集通路分析結果

KEGG通路富集分析發現，27個交集靶點基因顯著富集在17條通路上(P<0.05，FDR<0.01)，見圖8，其中最有意義的10條通路包括細胞衰老信號通路、甾類激素生物合成信號通路、p53信號通路、化學性致癌信號通路、IL-17信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、視黃醇新陳代謝信號通路、藥物代謝-細胞色素P450信號通路、代謝細胞色素P450的外源性物質信號通路、類風濕性關節炎信號通路，提示逍遙散通過作用以上多條通路來發揮治療HCC的作用。

2.7 逍遙散核心成分作用于CYP1A2、PTGS2和CDK1的分子對接驗證

對“逍遙散有效成分—靶點”調控網絡分析可知，山奈酚、槲皮素與β-谷甾醇是逍遙散作用于HCC最為關鍵的核心成分，CYP1A2、PTGS2和CDK1不僅作為疾病的靶點，也同樣出現在最終所得的PPI蛋白互作網絡之中且度值較高。一般認為配體與受體結合的構象穩定時能量越低，發生的作用可能性越大。分子對接結果顯示槲皮素與CYP1A2和PTGS2，β-谷甾醇與PTGS2和CDK1，山奈酚與PTGS2和CYP1A2的分子對接結合能均遠遠小于0 kJ/mol，由此表明二者之間具有較好的結合活性，結果見表3和圖9～14。

表3 逍遙散中部分核心活性成分與CYP3A4、PTGS2和CDK1的結合能

圖9 槲皮素-PTGS2Fig.9 Quercetin-PTGS2

圖10 β-谷甾醇-PTGS2Fig.10 β - sitosterol-PTGS2

圖12 β-谷甾醇-CDK1Fig.12 β-Sitosterol-CDK1

圖13 山奈酚-CYP1A2Fig.13 Kaempferol-CYP1A2

圖14 山奈酚-PTGS2Fig.14 Kaempferol-PTGS2

3 討論

網絡藥理學是通過分析大數據來進行藥物研究的新模式。將網絡藥理學與傳統的中醫藥有機結合，其整體性、系統性、動態性的特點與中醫整體觀念、辨證論治的理論相一致[10]。使用網絡藥理學方法研究中藥復方的作用機制是當下藥理學研究的一個熱點[11]。逍遙散具有疏肝解郁，養血健脾，調和肝脾之功，是和解劑的代表方之一，臨床中常用以治療原發性肝癌。本研究借助網絡藥理學手段，初步挖掘、分析逍遙散在干預HCC中多成分、多靶點、多途徑的治療機制。

本研究分析了原發性肝癌與正常人相比其致癌的差異基因，得到明顯影響和改變的基因共580個，其中上調基因280個，下調基因413個，并將此作為疾病干預的靶基因。接著系統分析了逍遙散6味中藥(柴胡、白芍、甘草、白術、當歸、茯苓)的有效成分，構建有效成分-靶點網絡，分析化合物與靶點的相互作用關系。其中槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚等是有效成分—靶點網絡中的關鍵。槲皮素是甘草中的有效成分，β-谷甾醇是當歸中的有效成分，山柰酚是甘草中的有效成分。已有研究表明，槲皮素具有良好的抑制細胞增殖，調控血管新生的作用，能夠抑制體外培養的人臍靜脈血管內皮細胞(EVC304)生長[12]；具有抗腫瘤，抑制Eca109細胞的遷移、侵襲及血管新生[13]，下調VEGF[14]的作用；同時還可以降低毛細血管脆性、擴張冠狀動脈、增加冠脈血流量等。β-谷甾醇主要是抑制血管新生，其通過調節VEGF的表達，對H22荷瘤小鼠具有一定的抑瘤作用[15]，還能夠調節人肺癌A549細胞增殖及凋亡[16]。山柰酚是一種有抗炎、抗氧化作用的黃酮類化合物；具有明顯的抗腫瘤作用，高攝入山柰酚可降低晚期大腸腺瘤的復發，體外實驗表明山柰酚對小鼠黑色素瘤細胞B16具有增殖抑制作用[17]；還能通過抑制銅離子誘導低密度脂蛋白氧化，成為氧化低密度脂蛋白，能降低單核巨噬細胞表面CD36蛋白的表達，阻止該細胞對氧化低密度脂蛋白的攝取，有效預防動脈粥樣硬化。除此之外，化合物中的多個成分具有抑制血管生長、減低細胞侵襲力、下調VECF表達等抗腫瘤機制作用。

對逍遙散的靶點進行PPI映射并構建網絡，對網絡分析后發現了多個與多種復雜疾病緊密相關的關鍵靶點，如TP53、HSP90AB1、HSP90AA1、VCP、TOP2A、ITGA4、VCAM1、ESR1、HSPA8、MDM2等。研究將有效成分中的核心成分槲皮素、β-谷甾醇與關鍵靶基因進行了分子對接驗證，證明了其具有良好的親和力，進一步佐證了本次研究的科學性。為了說明作用靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究進行了 GO 功能富集和KEGG 通路富集分析。發現逍遙散能夠調節細胞對無機物的反應、細胞激素代謝、細胞周期素依賴性蛋白激酶全酶復合物、趨化因子活性及受體結合、激素代謝等功能，大多數基因富集到了與癌癥有直接或間接關系的通路上，包括甾體激素生物合成通路、P53信號通路、細胞衰老通路、化學致癌通路、IL-17信號通路、TNF信號通路、視黃醇代謝通路、藥物代謝-細胞色素p450通路、孕酮介導的卵母細胞成熟通路等。已有研究表明P53信號通路能夠調節細胞周期、活化凋亡信號轉導，進而誘導細胞凋亡。其通路中的p53蛋白大量表達時，可以上調Bcl-2的表達水平、下調Bax的表達來共同完成細胞凋亡的調控[18]。Zhu等[19]發現TNF信號通路激活時可提高了人肝癌細胞株MHCC-97L中的VEGF及MMP9的表達，使得癌細胞的侵襲能力得到增強。據此，可以推斷逍遙散可能通過抑制該通路來達到延緩HCC發生發展的目的。IL-17通路是一條與炎癥反應相關的信號通路，近年來研究發現，IL-17在抗腫瘤治療中同樣發揮著重要作用。當IL-17通路被激活時，荷瘤小鼠體內的 MHCⅠ、MHCⅡ和LFA-1大量表達，同時促進了IFN-γ、IL-12的分泌、進而發揮CTL殺傷腫瘤細胞的作用[20]。

已有研究表明逍遙散能夠抑制實體腫瘤的生長，并且對荷瘤造成的脾和胸腺指數具有一定的恢復作用[21]；通過引起細胞內鈣離子變化，誘導肝癌 SMMC-7721細胞凋亡[22]；提高機體免疫功能和調節癌基因的表達[23]；抑制MCF-7的細胞生長，誘導細胞自噬性死亡等[24]。但對于其所影響的具體蛋白，具體信號通路的研究尚少，根據本次研究分析結果可以推斷其影響與肝癌直接或間接相關的蛋白及通路對肝癌組織進行抑制，從而達到一定的治療目的。

綜上所述，本研究應用網絡藥理學方法，初步探究了逍遙散多成分、多靶點、多通路的復雜機制過程，對進一步理解藥物—靶點相互作用機制提供了重要信息，為后續從逍遙散中提取有效藥物成分治療HCC提供了依據，也對未來論證中醫藥基礎理論的科學性提供了參考。