高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點多態性研究

趙曉麗，岳薇薇，苗文清，錢 凈，朱 丹，李穗雯，楊悅林，黎海生，胡大春

（昆明醫科大學附屬甘美醫院檢驗科，云南昆明 650011）

原發性高血壓是最常見的危害人體健康的心血管疾病，是在遺傳易感的基礎上，多種環境因素綜合作用的結果。2018 年《中國高血壓防治指南》指出[1]。心腦血管疾病死亡占總死亡人數的40%以上，其中高血壓是心腦血管病發病的第一危險因素。高血壓病的病因病理機制復雜，其中鈉肽家族及其受體起著舉足輕重的作用[2-3]。前人及筆者前期的研究均發現高血壓患者存在NPR-C 基因A-55C 位點多態性，并影響高血壓病的發生，但其在病理機制中的作用并不清楚。NPR-C 基因A-55C 位點處于基因表達調控區，推測該位點多態性有可能影響NPR-C 的表達，進而影響其對配體ANP 的清除，或影響NPR-C 及其配體結合后的信號通路。為此，本研究試圖通過對高血壓病患者NPR-C 基因A-55C 位點多態性與外周血調節血壓相關因素的分析，對上述假設給予證實。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 高血壓患者的納入標準（1） 云南漢族的界定：父系、母系三代均為漢族，均居住云南境內；（2） 高血壓的診斷標準：參照2018 年《中國高血壓防治指南》[1]，用以下標準篩選:在未使用降壓藥物的情況下，非同日3 次測量血壓，收縮壓≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa） 和/或舒張壓≥90 mmHg；患者既往有高血壓史，現正在服抗高血壓藥，雖血壓＜140/90 mmHg，仍診斷為高血壓；家庭血壓≥135/85 mmHg；動態血壓白天平均值≥135/85 mmHg，或24 h 平均值≥130/80 mmHg 診斷為高血壓；（3） 高血壓患者的年齡在40～80 歲之間；（4） 研究對象個體間無血緣關系。

1.1.2 入選標準 有臨床或實驗室信息提示為繼發性高血壓者。

1.1.3 研究對象剔除標準（1） 研究對象的民族界定不清或基本特征指標信息不清者；（2） 觀察指標檢測失敗者。

1.1.4 研究對象的來源 2018 年1 月至6 月選取在昆明醫科大學附屬甘美醫院健康體檢、門診和住院就診中發現的原發性高血壓患者100 例。其中男性48 例，女性52 例；高血壓合并冠心病者64例，高血壓未合并冠心病者36 例；高血壓合并糖尿病者25 例，高血壓未合并糖尿病者75 例。

1.1.5 倫理學措施 本研究經昆明醫科大學附屬甘美醫院倫理委員會批準，入選患者已填寫知情同意書。

1.2 樣本采集與保存

采用含EDTAK2 采血管，經肘靜脈采集空腹靜脈血2 mL，采血后立即顛倒混勻并標記，將標記好的標本置于-80℃超低溫冰箱保存備用。

1.3 實驗試劑

PCR 反應試劑、FastDigest CseI、溴酚藍為Fermentas 公司產品；DNA Marker # DL500 為Takara 公司產品；瓊脂糖為Santaibio 公司產品；TAE 緩沖液為上海創賽科學儀器有限公司產品；DNA 提取液為廣州中山達安基因股份有限公司產品；溴化乙錠為上海聯邁生物工程有限公司產品；引物由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

1.4 實驗儀器

Gel Doc 2000TM 凝膠成像分析系統、MyCycler，Bio-RadPCR 擴增儀；Heraeus 低溫高速離心機；Milipore 超純水機；Power PAC 3000 電泳儀；電熱恒溫水浴箱；漩渦振蕩器。

1.5 實驗方法

1.5.1 基因組DNA 的提取 根據試劑說明書使用血液基因組DNA 提取試劑盒快速提取基因組DNA。

1.5.2 引物序列 NPR-C 基因A-55C 引物序列引用文獻[4]中的引物，由生工生物工程（上海） 有限公司合成。

NPR-C 基因A-55C 位點引物序列如下：

F（5'-3'）：CACCGTCAATTACAAACACTTGGA CAAGTCTAAC

R（5'-3'）：CACCCTTCCTCTTTCCTCCCCACT CTTCTCTCCA

1.5.3 目的片段PCR 反應體系和條件 PCR 反應體系：總體積50 μL，含DNA 模板3 μL，正向引物和反向引物各0.5 μL，DreamTaq Green PCR Master Mix（2X） 25 μL，無核酸酶水，21 μL。擴增條件：95℃預變性3 min，96℃變性50 s，58℃退火50 s，72 ℃延伸60 s，30 個循環，最后72℃再延伸5 min。

1.5.4 目的片段PCR 擴增產物HgaI 酶切反應體系 采用PCR-RFLP 法對目的片段PCR 擴增產物酶切，反應體系為：無核酸酶水1.5 μL，10×快速限制性內切酶緩沖液2 μL，PCR 擴增產物25 μL，HgaI 酶1.5 μL。將上述體系混勻，離心機快速離心10 s，使反應體系集中，然后37℃水浴30 min進行PCR 擴增產物酶切。

1.5.5 1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產物分析配制1.5%的瓊脂糖凝膠，電壓120 V，電泳45 min，取20 μL 酶切產物點樣，在凝膠成像儀上觀察結果。根據HgaI 酶切片段的數量與長度不同，判斷基因型：酶切產物出現105 bp、265 bp 兩個片段者判為AA 純合型；出現88 bp、105 bp、177 bp 3 個片段者判為CC 純合型；出現88 bp、105 bp、177 bp、265 bp 4 個片段者判為AC 雜合型。

1.6 質量控制

所有觀察指標的檢測均參加國家衛計委臨床檢驗中心組織的室間質量評價活動，成績優秀。

1.7 統計學處理

對基因型和等位基因頻率分布進行Hardy-Weinberg 平衡檢測，當P＞0.05 時，說明群體基因遺傳平衡，數據來自同一蒙德爾群體。

2 結果

2.1 研究對象NPR-C 基因A-55C 位點多態性檢測結果

100 例云南漢族原發性高血壓患者樣本NPR-C 基因A-55C 位點檢測結果顯示：100 例樣本中未檢出AA 基因型，檢出AC 和CC 基因型，其中AC 基因型25 例，CC 基因型75 例。部分患者目的片段PCR 擴增產物及其酶切片段電泳結果見圖1。

圖1 基因多態性檢測結果Fig.1 Test results of gene polymorphism

2.2 原發性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點基因型和等位基因頻率分布

100 例云南漢族高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點基因型和等位基因頻率分布見表1。結果顯示研究對象中CC 基因型頻率是AC 基因型頻率的3 倍，C 等位基因頻率是A 等位基因頻率的7倍。各基因型和等位基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P=0.153）。

3 討論

原發性高血壓的病理機制十分復雜。長期血壓升高極易引發患者心、腦、腎、大血管等諸多靶器官出現相應病理改變，進而引發嚴重的心、腦、腎等器官并發癥[5]。但目前高血壓病尚無治愈措施，臨床主要為對癥治療。探索原發性高血壓的病因病理機制對治療和預防該病有十分重要的意義。本課題在前期研究的基礎上，進一步探索NPR-C 基因A-55C 位點多態性在原發性高血壓中的病理機制中的作用，為闡明原發性高血壓病因病理機制提供線索。

表1 高血壓病患者NPR-C 基因A-55C 位點基因型和等位基因頻率分布［n（%）］Tab.1 The genotypic and allelic distributions of A-55C of NPR-CGene in essential hypertension［n（%）］

國內外有較多有關NPR-C 基因位點多態性與原發性高血壓易感性的相關研究報道[6-8]。Ehret G B等人[9]對20 萬歐洲人進行關于血壓的全基因組關聯研究中發現NPR3 基因3，側翼序列rs1173771 位點多態性與歐洲人原發性高血壓易感性相關。Kato等[10]通過對19 608 名具有東亞血統的受試者收縮壓和舒張壓的全基因組關聯研究進行薈萃分析，發現NPR-C 基因rs1173766 位點多態性與東亞和日本人群高血壓病易感性相關。Sarzani R 等[4]對84 例患原發性高血壓的高加索人進行研究得出NPR-C 基因A-55C 位點的基因型頻率為AA（0.035）、AC（0.297）、CC（0.668）。最近一項研究發現在歐洲人NPR3-C5orf23（rs1173771） 與高血壓易感性相關[11]。筆者先前用DNA 雜交芯片技術對100 例云南漢族原發性高血壓患者和97 例健康人進行了NPR-C 基因A-55C 位點多態性檢測，結果顯示CC 基因型增加了原發性高血壓的易感性，其OR值達3.77[12]。本次研究采用RFLP-PCR 法測定了100 例云南漢族原發性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點多態性，結果顯示原發性高血壓患者NPR-C 基因A-55C 位點基因型頻率分別為AA（0）、AC（0.25）、CC（0.75）；NPR-C 基因A-55C位點等位基因頻率為A（0.125）、C（0.875），兩次分別檢測不同的100 例云南漢族原發性高血壓患者該位點基因多態性都沒有檢測到AA 基因型，提示NPR-C 基因A-55C 位點多態性存在種族差異，但兩次研究結果均可提示CC 基因型與原發性高血壓易感有關，并與Sarzani R 等[4]的結果相似。

綜上所述，較多研究提示NPR-C 基因多態性可能參與了高血壓的發生發展[13-15]，但迄今鮮見關于NPR-C 基因A-55C 位點多態性在原發性高血壓病理機制中作用的研究報道。本研究結果提示NPR-C 基因A-55C 位點CC 基因型與原發性高血壓易感相關，上述結果為NPR-C 基因A-55C 位點突變在原發性高血壓中的遺傳病理機制的研究提供了有價值的實驗室數據。今后我們課題組會在這方面做更深一步的研究。