異氟烷對腦缺血再灌注腦損傷的保護作用及對海馬區c-fos 和Bax 表達的影響

黃治國，殷 維，晏 毅

（中國人民解放軍聯勤保障部隊九二零醫院麻醉科，云南昆明 650118）

腦缺血再灌注后產生的損傷包括自由基的產生、氧化應激作用、興奮性氨基酸毒性作用及神經元內鈣超載，促使大量神經遞質釋放，最終導致神經細胞凋亡的發生[1]。異氟烷是應用于臨床最廣泛的吸入麻醉藥之一，經過多年的臨床應用發現它具有降低顱內壓、減少腦內氧耗、誘導與維持平衡、蘇醒快、副作用少等特點。有關吸入麻醉藥對缺血神經元保護作用的機制，盡管已經提出了許多假說[2-3]，但其較深層次的作用機制迄今為止仍不很清楚。本文通過構建腦缺血再灌注大鼠模型，觀察吸入不同濃度異氟烷（isoflurane,IF） 對大鼠神經功能的改變及其對缺血神經元c-fos，Bax 表達的影響，為進一步明確異氟烷的神經保護作用以及相應的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF 級雄性Wistar 大鼠，32 只，體重（200±20） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCK（京） 2016-0006。12 h 循環光照，室溫20℃～25℃，自由飲水和攝食。

1.2 主要試劑和儀器

大鼠c-fos、Bax、β-actin 引物合成（上海生工生物工程有限公司）；c-Fos，Bax 抗體（CST，Danvers，MA，USA）；β-actin 抗體及相應二抗（Santa Cruz，USA）；RIPA 裂解液，Trizol 提取試劑，逆轉錄試劑盒（Fermentas）；異氟烷（瑞沃德生命科技有限公司）；SOD，MDA 檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；儀器：腦立體定位儀B3E03-004（瑞沃德生命科技有限公司），電凝止血器（上海亮直醫療器械有限公司），微型電鉆P-500-3（施力特），動脈夾（北京冀諾泰科技發展有限公司）；多功能酶標儀（Thermo），超低溫冰箱（Thermo），低溫高速離心機（Beckman）；自制呼吸箱；恒溫水浴箱（美國scilogex）；熒光定量PCR 儀（ABI StepOne），低溫離心機（HITACH：CF-16RX）；大鼠線栓（廣州佳靈）。

1.3 動物分組及缺血模型制備

大鼠經戊巴比妥鈉（來自昆明醫科大學動物學部，35 mg/kg） 腹腔注射麻醉，體溫由直腸探頭監視，將大鼠放在可控溫電熱毯上面，體溫維持在（37.0±1.0） ℃，在體式顯微鏡下，取頸旁正中切口，分離頸前筋膜與肌肉組織，在甲狀軟骨上緣分離出左側ECA、ICA，絲線結扎ECA，將ECA 剪斷，微型血管夾暫時夾閉CCA 近分叉處和ICA 遠端，于ECA 殘端用顯微剪制備適當的小口，使用大鼠專用栓線進入該切口，當線栓準確進入ICA后再將ECA 的松結結扎，最后將ICA 遠處留置的動脈夾打開，線栓插入距離ICA 和ECA 分叉處8～9 mm，感到阻力后即停止插入線栓，使線栓完全固定，將動脈夾取下，構建MCA 阻塞，MCAO梗阻2 h 后，拔除線栓，恢復血供，形成缺血再灌注損傷，徹底清洗并縫合手術切口。置飼養籠中觀察。動物隨機分為四組：假手術組（Sham），缺血組（IR），IR+IF（1.5%） 組，IR+IF（2.0%） 組。假手術組只手術暴露，不插入線栓以及MCA 栓塞，術后4 h 取材。吸入麻醉藥組在制成腦缺血再灌注模型后，置于呼吸箱內，于缺血期間分別持續吸入最低肺泡有效濃度1.5%，2.0%的異氟烷。每組8 只大鼠，其中4 只取材后進行腦組織含水量測定，另外4 只，新鮮取材各大鼠右側海馬組織，分為3 份，-80℃凍存備用。

1.4 神經功能行為缺陷評分

再灌注4 h 后對大鼠進行神經損害嚴重程度評分（neurological severity score，NSS）[4]，NSS 包含了運動、感覺、反射及平衡實驗，最低0 分，最高18 分。0 分為神經功能正常；1～6 分為輕度損害；7～12 分為中度損害；13～18 分為神經功能重度損害。

1.5 大鼠腦組織含水量測定

神經功能行為缺陷評分后，各組大鼠均用戊巴比妥鈉（35 mg/kg 腹腔注射） 麻醉后，斷頭取腦，迅速切取右側大腦半球，濾紙吸干其表面血漬，電子天平精確稱重后，置于120℃恒溫干燥箱內烘烤48 h 至恒重，再精確稱重，采用干濕重法測定腦組織含水量，以百分率表示。計算公式為：腦組織含水量=（濕腦重量-干腦重量）/濕腦重量×100%。

1.6 腦組織中SOD，MDA 含量檢測

-80℃冰箱取出1 份海馬組織加入4℃生理鹽水制備組織勻漿，離心取上清液，分為兩份，按試劑盒說明書檢測SOD，MDA 含量。

1.7 實時定量RT-PCR

-80℃取出第2 份海馬組織進行總RNA 提取，參照Trizol 試劑盒說明書進行。每個樣本取1 μg總RNA 作為逆轉錄模板合成cDNA。所用引物見。PCR 反應條件：94℃2 min；94℃20 s、60℃30 s、72℃30 s，共40 個循環；產物經溶解曲線單峰驗證，記錄每個反應管中的熒光信號達到所設定值時所需的循環數（Ct 值），△△Ct=（Ct目的基因-Ctβ-actin） 治療組-（Ct目的基因-Ctβ-actin） 對照組，數據采用2-△△Ct法分析，計算目的基因與內參β-actin 比值作為目的基因的相對表達量，見表1。

表1 實時定量PCR 檢測所用引物序列Tab.1 Primer sequence list for quantitative real-time PCR

1.8 Western blot 檢測蛋白表達

-80℃取出剩余的1 份海馬組織，加入RIPA裂解液制備樣本總蛋白，加入4 倍體積的上樣緩沖液，沸水中變性3 min，離心后收集上清液，上樣，電泳分離后，200 V、400 mA 轉膜2.5 h，封閉、洗膜后，加入用TBST 稀釋的一抗（β-actin，1:200；c-Fos，1:1 000；Bax，1:1 000），4℃冰箱搖晃孵育過夜。再用TBST 溶液洗膜3 次，每次10 min，加入HRP 標記的二抗，室溫下搖晃孵育2～4 h，化學發光成像系統下顯色。

1.9 統計學處理

數據采用SPSS 統計學軟件進行統計學分析，結果均以均數±標準差（±s） 表示；假設檢驗采用單因素方差分析，兩組間差異比較使用LSD檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 異氟烷處理后腦缺血再灌注大鼠行為學變化

缺血再灌注損傷4 h 后，各組行為學評分顯示：Sham 組未觀察到任何神經功能損傷，IR 組（15.20±1.398），IR+IF（1.5%） 組（9.40±3.273），IR+IF（2.0%） 組（3.60±2.413），兩組間評分存在差異（P＜0.05），提示異氟烷處理能促進大鼠腦缺血后神經功能修復。

2.2 腦組織含水量

再灌注后4 h，與模型組（84.33±1.408） %相比，假手術組的（78.59±2.030） %腦組織含水量較低，說明IR 組有明顯的腦水腫，1.5%異氟烷處理組的（81.03±2.897） %的腦組織含水量有一定下降，但差異不明顯（P＞0.05）；2.0%異氟烷處理組（79.25±2.029） %的腦組織含水量下降更為顯著（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠神經功能缺損行為學評分和腦腦組織含水量比較（±s）Tab.2 Comparison of NSS score and the water content in brain tissue among different groups（±s）

表2 各組大鼠神經功能缺損行為學評分和腦腦組織含水量比較（±s）Tab.2 Comparison of NSS score and the water content in brain tissue among different groups（±s）

與IR 組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.3 異氟烷處理后腦組織中SOD，MDA 含量

與假手術組相比，模型組腦組織勻漿中SOD活性明顯降低，而MDA 含量顯著增高，經1.5%異氟烷處理后，腦組織勻漿中SOD 酶活性較模型組有相應改善，且MDA 含量明顯降低，2.0%異氟烷處理組較1.5%組效果有增強，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 異氟烷處理對腦缺血再灌注后SOD 和MDA 的影響Fig.1 The effects of Isoflurane posttreatment on the release of SOD and MDA following cerebral ischemia reperfusion

2.4 異氟烷處理后腦缺血再灌注大鼠腦組織中c-fos 和Bax 表達變化

qRT-PCR 檢測結果顯示異氟烷對腦缺血再灌注大鼠海馬中c-fos 和Bax 的表達具有明顯的調節作用。缺血再灌注之后，c-fos 和Bax mRNA 在大鼠腦組織海馬區中表達明顯增強；與IR 模型組相比，1.5%和2.0%異氟烷均可明顯降低c-fos 和Bax的mRNA 表達量，并且組間差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 qRT-PCR 檢測異氟烷處理對腦缺血再灌注后后c-fos 和Bax 的影響Fig.2 The effects of Isoflurane posttreatment on the expression of c-fos and Bax following cerebral ischemia reperfusion by qRT-PCR

2.5 Western blot 結果

與假手術組相比，模型組海馬區組織中c-fos和Bax 蛋白表達量明顯升高，經1.5%異氟烷處理后，海馬區組織中c-fos 和Bax 蛋白表達量較模型組顯著降低，且差異有統計學意義（P＜0.05）；2.0%異氟烷處理組較1.5%組效果有增強，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 Western blot 檢測異氟烷處理對腦缺血再灌注后c-fos 和Bax 的影響Fig.3 The effects of Isoflurane posttreatment on the expression of c-fos and Ba following cerebral ischemia reperfusion by Western blot

3 討論

即早基因（immediate early gene，IEG） 在體內發揮第三信使的作用，被發現普遍存在于中樞神經細胞中，正常狀態下呈現低表達，難于檢測。但在神經細胞接受內源刺激后，早期快反應基因即出現快速表達[6]，作用于目的基因，導致目的基因轉錄水平發生改變，參與調節神經細胞的生長、分化和損傷修復。研究腦損傷時早期快速反應基因表達的意義在于明確他們對于繼發性病理損害過程發生與發展的影響，尤其是在神經細胞損傷機理與抗損傷修復機制中的作用。研究已證實，中樞神經系統在受到如腦缺血、癲癇發作等損害性刺激時，即早基因c-fos、c-jun 出現異常高表達。藥物誘發癲癇時，腦不同部位出現c-fos、c-jun mRNA 及其蛋白表達，并于用藥后15 min 開始表達，1 h 后達到高峰，16 h 后恢復正常水平[7]。c-fos 作為即早基因中的研究熱點之一，參與神經細胞生長、發育、分化、記憶和信息傳遞等生理過程。大腦在受到缺血缺氧、創傷性損傷等多種刺激后，可激活中樞神經系統（nervous system，CNS） 中c-Jun、c-Fos 基因的表達。

Bax 作為Bcl-2 家族蛋白中的第一個促進細胞凋亡的因子，其分子量大約為21 κD。Bax 通常以單體形式分布于細胞漿中，并均勻圍繞在線粒體外膜周圍[8]。Bax 可通過調節線粒體PT 孔破壞線粒體膜的完整性，改變線粒體膜的通透性，導致線粒體跨膜電位丟失，釋放線粒體內的細胞色素C等促凋亡因子到細胞質內，進而激活Caspase 級聯反應[9]。線粒體PT 孔的改變，導致線粒體內外之間Ca2+、pH 值、電荷發生變化，影響呼吸鏈的正常進行。Bax 蛋白還可以增加Ca2+釋放，釋放的Ca2+可以直接激活Caspase 效應分子或使線粒體對各種內、外源性凋亡刺激因素敏感性增高，促進細胞凋亡的發生[10]。眾多研究都表明神經細胞凋亡在腦缺血再灌注損傷過程中的的重要作用，如何減弱、抑制神經細胞的凋亡也成為對于腦缺血再灌注損傷治療的一個重要方向[11]。

腦缺血再灌的一個早期反應是海馬神經元迅速表達c-fos 基因[12]。關于c-fos 表達的功能意義目前還爭議，但神經元受損導致c-fos 高表達這一點是肯定的[13]。Neumann-Henfelin 等[14]表 明Ca2+是c-fos 表達增強的激發劑。缺血再灌早期細胞內Ca2+濃度升高導致c-fos 的高表達。如上所述，由于異氟烷對Ca2+的內、外流均有阻滯作用[15]，因此也表現出對c-fos 表達的衰減作用。

綜上所述，本研究中發現異氟烷對于大鼠腦缺血再灌注損傷具有一定保護作用，可以改善大鼠因腦缺血引起的神經功能減弱、也可改善海馬區神經細胞的凋亡、還可抑制c-fos mRNA 表達，并且在一定程度上呈現出劑量依賴性。異氟烷因其安全、可控性好等優點，成為目前臨床上應用最為廣泛的吸入氟化麻醉藥之一。近年研究發現，異氟烷對神經系統的作用廣泛而復雜，因此積極開展異氟烷對神經系統作用機制的研究對于全面認識異氟烷具有積極的作用。