香蕉條斑病毒病和花葉病混合感染的癥狀及其分子檢測①

王艷瑋 漆艷香 曾凡云 張 欣 謝藝賢 彭 軍

(中國熱帶農業科學院環境與植物保護研究所 海南海口571101)

香蕉條斑病毒（Banana streak virus，BSV）和香蕉花葉心腐病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）是危害中國香蕉的2 種重要病毒，植株染病后矮縮甚至死亡，造成果實品質和產量嚴重下降。香蕉主要通過組培技術進行無性繁殖， 種苗一旦帶毒，將加劇香蕉病毒的傳播和危害。

香蕉條斑病毒是香蕉上的一種重要病毒。BSV屬于桿狀病毒屬（Badnavirus），含有7.2～7.8 kb的雙鏈環狀DNA（dsDNA）編碼3 個ORFs［1］。ORF1編碼功能未確定的小分子蛋白，可能與病毒粒子形成相關；ORF2 編碼一個大約14 ku 的蛋白，含有N 末端Coiled-coil 功能域，推測與病毒粒子組裝相關；ORF3 編碼一個復合蛋白，該蛋白通過剪切作用產生病毒外殼蛋白（Coat Protein， CP）、天冬氨酸酶（Aspartic Protease， AP）、反轉錄酶（Reverse Transcriptase， RT）、核糖核酸酶H（RNase H， RH）以及移動蛋白（Movement Protein， MP）等。BSV 具有整合進入香蕉基因組的特性。當香蕉受到外部環境脅迫，BSV 整合香蕉基因組的BSV，使其成為內源BSV（endogenous BSV，eBSV）游離出來獨立于染色體外，成為游離BSV（episomal BSV），從而使香蕉植株表現出染病癥狀［2］。據報道，近年來中國廣東、云南、海南等香蕉主要種植地區先后有香蕉條斑病發生，該病早期癥狀表現為米粒狀的褪綠，隨著癥狀的發展，葉片出現斷續或連續的褪綠條斑及梭形條斑，并可逐漸發展成壞死黑色條斑，假莖、葉柄及果穗有時也會出現條紋癥狀［3-4］。

香蕉花葉病是由黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）引起的一種病毒病，被該病毒侵染的香蕉會出現植株矮化的癥狀，且與正常植株對比，該病株的葉片會有濃綠鑲嵌的斑駁、花葉狀條紋或褪綠的梭狀斑，嚴重者嫩葉出現嚴重黃化或斑駁，直到變褐腐爛［5］。

為調查海南省BSV 和CMV 的發生情況，在2019年12 月份海南持續低溫的一周內對幾個主要香蕉種植園進行調查，為后續香蕉病毒病的防治以及健康組培苗的監測提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疑似病株

隨機采集海南澄邁、陵水部分香蕉種植園具BSV、CMV 疑似癥狀的病株，帶回實驗室保存，將經PCR 檢測、測序后確定有CMV、BSV 感染的香蕉植株作為陽性對照（+CK）， 健康香蕉植株作為陰性對照（-CK）。

1.1.2 試劑

TaqDNA 聚合酶等購自大連寶生物工程（Ta-KaRa）有限公司，引物由上海生物工程公司合成（HPLC 純化），RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒等購自TIANGEN 有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計

根據BSV 的ORF3 基因組序列設計BSV-P1/P2 特異性檢測引物（表1），可以擴增出eBSV/BSV 2 種形式的BSV［6］。根據CMV 外殼蛋白基因序列，通過比較多個株系之間的保守序列設計引物［7］。

表1 CMV 和BSV 引物序列

1.2.2 總RNA 的提取及cDNA合成

取0.1 g 的香蕉疑似樣品的葉片，用液氮充分研磨成細粉狀，收集至2 mL 離心管中并做好樣品標記。按照RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒的操作說明提取病葉RNA；用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測純度，Nanadrop 測定OD260/280，于-80℃條件下保存備用。

采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 試劑盒，將提取到的總RNA 反轉錄合成cDNA，再將cDNA 溶液放置于-20 ℃保存備用。

1.2.3 PCR擴增驗證

分別對BSV cDNA 和CMV cDNA 進行PCR 擴增，反應體系為50 μL（2×Taq mix 25.0 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，模板cDNA 2.0 μL，H2O 21.0 μL）；PCR 擴 增 條 件：94 ℃預 變 性5 min，95 ℃變性15 s，52 ℃退火15 s，72 ℃延長1 min ，進行35 次循環，72 ℃延長5 min ，16 ℃降溫5 min。取10 μL PCR 反應產物，用1%瓊脂糖凝膠進行電泳驗證。

2 結果與分析

2.1 田間觀察結果

田間觀察發現，部分田間香蕉葉片具斷續或連續的褪綠條斑，甚至部分葉片葉脈枯死，這些是BSV典型癥狀；而其他葉片出現棱形或不規則花葉斑駁狀，為典型CMV癥狀。部分香蕉植株頂部葉片有明顯的花葉狀斑紋，而下部的葉片則呈現褪綠條斑狀（圖1），分別與CMV 和BSV 的病毒癥狀一致，初步判斷為CMV和BSV混合感染。

2.2 BSV和CMV的PCR檢測

2.2.1 BSV檢測結果

PCR 擴增電泳結果中出現了2條亮度明顯的條帶，第一條帶位于1 000 bp 附近位置，第二條則在500～750 bp。與+CK 比對可知，第一條帶為目的片段，第二條帶則是整合到基因組的eBSV 擴增條帶。結果表明疑似癥狀香蕉植株都攜帶BSV，由于低溫脅迫，eBSV 游離出來，形成未整合到基因組、獨立于染色體外的游離BSV（episomal BSV），從而使香蕉植株表現出染病癥狀（圖2）。

2.2.2 CMV RT-PCR檢測結果

在BSV 檢測呈陽性的樣品中，隨機選擇10 個樣片提取RNA 后經反轉錄合成cDNA 后，CMV 擴增電泳結果顯示，擴增條帶與+CK 條帶對比完全一致，測序結果進一步驗證了疑似病株中的確存在香蕉花葉心腐病感染（圖3）。

3 討論

香蕉病毒病是限制香蕉產業健康發展的重要因素之一，不同病毒間可能會存在混合感染的現象，前期通過田間調查及分子檢測發現，在云南、海南、廣東等地區普遍存在BBTV 和CMV 混合感染的現象［7-8］。近年來由于未對香蕉條斑病毒進行嚴格檢疫，香蕉條斑病在華南地區的發生十分普遍。香蕉條斑病的癥狀與香蕉花葉病癥狀比較接近，且癥狀表現受到溫度的影響，因此難以根據癥狀進行準確判斷，給檢測造成了一定的困難。利用海南低溫天氣開展的田間癥狀調查顯示，具BSV、CMV 疑似癥狀的樣品大部分含有整合到基因組的eBSV和游離的BSV。此外，大部分感病香蕉植株的頂端葉片出現典型的CMV癥狀，而下部葉片出現典型的BSV 癥狀，隨機對部分BSV 陽性樣品進行CMV RT-PCR 檢測發現，此部分香蕉植株存在BSV 和CMV混合感染。后續隨著氣溫的升高以及香蕉的健康生長，BSV癥狀基本消失。

對于病毒病的防治，首先加強種苗的監測和檢測，保證無毒香蕉苗是控制該病的主要措施之一。香蕉無毒種苗主要通過組培工廠產業化生產，一旦種苗帶毒，病毒隨種苗擴繁將加劇香蕉病毒的傳播和危害。其次，當香蕉受到低溫脅迫時，會呈現更為明顯的香蕉條斑病毒癥狀。因此，在香蕉生長過程中注意觀察癥狀，并結合PCR檢測技術，防止種苗攜帶BSV病毒而造成嚴重危害。