鄒光進 謝紅煉 汪漢成 劉暢 黃宇 陳乾麗

摘要：牛糞中的酵母菌是重要的資源，在牛糞發(fā)酵的過程中具有重要作用。為了分離、鑒定牛糞中可培養(yǎng)的酵母菌，并研究其碳源代謝指紋圖譜，以發(fā)酵牛糞為材料，采用稀釋涂布平板法分離牛糞中的酵母菌，經(jīng)菌落觀察和鏡檢后，采用Biolog全自動微生物鑒定系統(tǒng)對分離菌株進行鑒定。結(jié)果表明，從發(fā)酵牛糞中共分離得到7株酵母菌，并且鑒定到了種水平，其中有3株為白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii），2株為約翰遜鎖擲孢酵母（Sporidiobolus johnsonii），1株為菱形伊薩酵母（Issatchenkia scutulata），1株為隱球酵母屬的Cryptococcus tsukubaensis。分離得到的4種酵母菌的碳源代謝能力和同化能力存在差異，Trichosporon beigelii能夠利用的碳源種類最多，具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，其次為Issatchenkia scutulata、Sporidiobolus johnsonii、Cryptococcus tsukubaensis;糊精是能被大部分酵母菌代謝的唯一碳源。牛糞中酵母菌代謝的特征性碳源信息及優(yōu)勢酵母菌菌株對于牛糞的快速腐熟堆肥具有一定的指導(dǎo)意義。

關(guān)鍵詞：牛糞;酵母菌;Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng);鑒定

中圖分類號： S182? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0305-05

牛糞自古以來都是農(nóng)作物的一種高效的有機肥，它養(yǎng)分全、肥效期長，所含微生物能夠促進植物對根際營養(yǎng)的吸收;牛糞還能夠減少土壤中養(yǎng)分的固定，提高化肥的肥效，也可以調(diào)節(jié)土壤理化性狀，改善土壤結(jié)構(gòu)[1]。此外，牛糞還作為飼料原料出現(xiàn)在各種動物飼料中。研究發(fā)現(xiàn)，新鮮牛糞中含有22.56%干物質(zhì)、3.10%粗蛋白、0.37%粗脂肪、9.84% 粗纖維、5.18%無氮浸出物、0.32%鈣、0.08% 磷;發(fā)酵后的牛糞具有酵母的特殊氣味，粗蛋白、粗脂肪含量分別增加了27.3%、5.1%，粗纖維含量減少，含有較多的營養(yǎng)物質(zhì)[2-3]。從牛糞中挖掘優(yōu)良酵母菌并加以開發(fā)利用，對于牛糞在植物肥料和飼料原料方面的應(yīng)用具有重要意義。目前，尚無牛糞中酵母菌分離與鑒定的報道。

基于形態(tài)特征、生理學(xué)特性等傳統(tǒng)的酵母菌鑒定方法耗時費力，且操作不方便[4]。近年來，酵母菌快速鑒定系統(tǒng)不斷更新?lián)Q代，出現(xiàn)了如API20C AUX、ATB32C、Vitek YBC和API Candid等系統(tǒng)[5-6]。由于這些鑒定系統(tǒng)主要應(yīng)用于臨床酵母菌的鑒定，因此針對性較強，但是能鑒定的酵母菌種類有限。目前，由美國Biolog公司開發(fā)的Biolog全自動微生物分析系統(tǒng)已經(jīng)能鑒定52個屬、267個種酵母菌，并且該系統(tǒng)能與計算機軟件連用進行數(shù)據(jù)分析，自動化和標準化程度高，鑒定速度快[7-8]，因而該系統(tǒng)在國際上常用于酵母菌的分類鑒定[9-10]。本研究旨在使用Biolog微生物全自動分析系統(tǒng)對腐熟牛糞中的優(yōu)勢酵母菌進行分離鑒定，并根據(jù)酵母菌在Biolog YT微孔板上的表型對其碳代謝特征進行初步研究，以期在微生物種類方面為商品牛糞和牛糞飼料的工業(yè)化開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗材料為充分腐熟的牛糞，采自奶牛場，經(jīng)自然發(fā)酵獲得。BUY培養(yǎng)基，購自美國Biolog公司。配制時稱取60 g BUY培養(yǎng)基，加入1 000 mL蒸餾水中，加熱攪拌溶解，待自然冷卻后調(diào)節(jié)pH值至5.6左右，于1×105 Pa條件下高壓蒸汽滅菌 20 min，倒制平板、備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 酵母菌的分離、純化 稱取5 g牛糞，加入裝有50 mL無菌水和適量玻璃珠的錐形瓶中，在 26 ℃、黑暗、轉(zhuǎn)速為130 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)30 min，取上清液進行稀釋，依次稀釋成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7系列濃度梯度的菌懸液。分別取100 μL不同濃度的菌懸液進行涂布，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，將平板置于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，48 h 后根據(jù)菌落形態(tài)特征及鏡檢形態(tài)特征對酵母菌進行初步鑒定。將菌株于BUY平板純化后接種于BUY斜面上，并于4 ℃低溫保存。

1.2.2 酵母菌的鑒定 將經(jīng)過純化后的酵母菌采用BUY平板轉(zhuǎn)接2代，置于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)48 h。將保存于4 ℃條件下的Biolog YT微孔鑒定板（圖1）和裝有無菌水的濁度管從冰箱中取出，使其自然恢復(fù)至室溫。調(diào)節(jié)濁度儀，使其在關(guān)機狀態(tài)下的讀數(shù)為0;開機后，使其測量無菌水的讀數(shù)為100%，測量YT濁度標準管的讀數(shù)為47%。用無菌水潤濕Biolog專用棉簽后蘸取新鮮菌體，沿著接種液管內(nèi)壁使菌體附著于內(nèi)壁上，并傾斜接種液管使菌體在接種液中混合均勻，通過向接種液中加入無菌水或者菌體來調(diào)節(jié)其濁度，使最終濁度為（47±3）%。將制備好的加菌接種液倒入無菌加樣槽中，用8頭移液器將接種液分別加至YT鑒定板的各孔內(nèi)，每孔100 μL。將鑒定板置于無菌、保濕的自封袋中，于26 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。分別在培養(yǎng)24、48、72 h時，將鑒定板放置于Biolog全自動微生物鑒定系統(tǒng)中進行鑒定，采用MicroLog 3軟件讀取數(shù)據(jù)，并與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行自動化比對，得到4個最大匹配度的菌種名稱，獲得酵母菌的鑒定結(jié)果。

1.2.3 酵母菌的表型代謝分析 酵母菌于微孔板中培養(yǎng)72 h后，觀察酵母菌在YT微孔板中的代謝反應(yīng)，從而得出各種酵母菌的碳源代謝情況，隨后進行碳源代謝特征的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛糞酵母菌的分離

利用涂布稀釋法從發(fā)酵牛糞中分離得到了酵母菌，通過觀察發(fā)現(xiàn)，高濃度（10-2、10-3）稀釋液培養(yǎng)基上長出的菌落較多，10-4、10-5和10-6低濃度稀釋液培養(yǎng)基上鮮有酵母菌長出。挑取不同性狀、顏色和生長速度的7株酵母進行純化培養(yǎng)，并依次編號為NF-1、NF-2、NF-3、NF-4、NF-5、NF-6和NF-7。

2.2 牛糞酵母菌的鑒定

用Biolog MicroLog 3軟件讀取96孔微孔板的濁度，并與數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)進行匹配，得到4個匹配度最高的酵母菌種類，結(jié)果中包括3個參數(shù)，即可能性（probability，簡稱PROB）、相似性（similarity，簡稱SIM）和位距（distance，簡稱DIS），其中PROB表示鑒定結(jié)果的可能性大小，SIM表示讀取的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的匹配程度。酵母菌在培養(yǎng)24 h時，SIM應(yīng)≥0.75，在培養(yǎng)48、72 h時，SIM應(yīng)≥0.50。當(dāng)DIST≤5.0、SIM越接近1.00時，鑒定結(jié)果的準確度越高。如表1所示，7株酵母菌在Biolog YT板中培養(yǎng)48 h后得到了準確鑒定，其中有3株為白吉利毛孢子菌（Trichosporon beigelii），2株為約翰遜鎖擲孢酵母（Sporidiobolus johnsonii），1株為菱形伊薩酵母（Issatchenkia scutulata），1株為隱球酵母屬的Cryptococcus tsukubaensis。

2.3 牛糞酵母菌的碳源代謝特征分析

96孔微孔鑒定板含有多種脫水碳源，Biolog酵母菌全自動鑒定系統(tǒng)通過在96孔微孔板中培養(yǎng)酵母菌，使其發(fā)生氧化還原反應(yīng)和同化反應(yīng)，圖1中 A～C行的結(jié)果基于顯色反應(yīng)原理，D～H行的結(jié)果基于反應(yīng)濁度差異原理。當(dāng)酵母菌利用微孔中的碳源時，A～C行孔內(nèi)的四唑紫染色劑會由無色被還原成紫色;當(dāng)酵母菌同化D～H行微孔中的碳源時，相應(yīng)微孔中的濁度會增加。因此，用Biolog YT微孔板鑒定可以得到酵母菌碳源代謝的特征性“指紋圖譜”。

Trichosporon beigelii、Sporidiobolus johnsonii、Issatchenkia scutulata和Cryptococcus tsukubaensis在Biolog YT微孔板上的鑒定結(jié)果見圖2。可以看出，Trichosporon beigelii代謝的碳源種類最多，有25種，主要包括α-D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、琥珀酸、L-天冬氨酸和甲酸等，不能代謝的碳源有7種，處于代謝邊界值的有4種;Cryptococcus tsukubaensis可以代謝的碳源數(shù)量次之，有3種，包括糊精、蔗糖和水楊苷，不能代謝的碳源有11種，處于代謝邊界值的有22種;Sporidiobolus johnsonii能代謝的碳源僅有糊精、α-D-葡萄糖2種碳源，不能代謝的碳源有19種，處于代謝邊界值的有15種;Issatchenkia scutulata不能代謝的碳源有23種，處于代謝邊界值的有13種。

此外，4種酵母菌對碳源的同化能力有較大差異，其中Trichosporon beigelii可以同化的碳源種類最多（24種），主要包括L-蘋果酸、D-葡萄糖酸、2-酮基-D-葡萄糖酸、L-谷氨酸、D-松三糖、反丁烯二酸等，不能同化的碳源有8種，處于邊界值的有28種;Issatchenkia scutulata可以同化的碳源有14種，主要包括L-阿拉伯糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-海藻糖、蔗糖、L-蘋果酸、糊精+D-木糖等，不能同化的碳源有33種，處于邊界值的有13種;Sporidiobolus johnsonii可以同化的碳源有14種，主要包括熊果苷、N-乙酰-D-葡萄糖胺、糊精、蔗糖、糊精+D-木糖、D-海藻糖等，不能同化的碳源有34種，處于邊界值的有12種;Cryptococcus tsukubaensis可以同化的碳源有13種，主要包括反丁烯二酸、L-蘋果酸、龍膽二糖、麥芽糖、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、α-D-葡萄糖、糊精等，不能同化的碳源有27種，處于邊界值的有20種。

3 討論

酵母菌為單細胞真菌，主要由擔(dān)子菌亞門、子囊菌亞門真菌組成。傳統(tǒng)的酵母菌鑒定方法包括形態(tài)學(xué)特征及生理生化測試等，但程序繁瑣，工作量大。基于26S rDNA的D1/D2區(qū)和內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列是目前酵母菌分子鑒定常用的比對目標，雖然可以鑒定大部分酵母菌，但這些區(qū)域數(shù)據(jù)庫目前仍在發(fā)展完善中，許多酵母菌的種間差異仍不能夠完全區(qū)分[11]。基于碳代謝機制的Biolog微生物鑒定技術(shù)可以彌補這一不足，然而Biolog酵母菌鑒定板僅能鑒定其數(shù)據(jù)庫中包含的酵母菌，而不能鑒定Biolog全自動鑒定系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中沒有的酵母菌種類，因此該數(shù)據(jù)庫還有待進一步完善和補充[12]。在今后的研究中，Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)可與PCR檢測結(jié)果互相驗證，互為補充[13]。本研究首次采用Biolog微生物鑒定系統(tǒng)對牛糞中可培養(yǎng)酵母菌進行了鑒定研究，為牛糞酵母菌的資源化開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

目前，酵母菌已被廣泛應(yīng)用于食品生產(chǎn)、釀酒工業(yè)、飼料等多個領(lǐng)域。發(fā)酵是酵母菌的主要功能之一，它可以縮短饅頭、面包等的發(fā)酵時間，還能釀造出醬、醋、葡萄酒、飲料等多種產(chǎn)品，酵母菌還可以作為飼料添加物用于家畜飼料生產(chǎn)。隨著我國有機（類）肥料的發(fā)展，肥料微生物的研究與應(yīng)用越來越被重視，報道較多的有細菌、放線菌和真菌，而很少有酵母菌相關(guān)的報道，特別是關(guān)于家畜糞便及其堆肥中酵母菌的研究。吳媛等于2011年報道，鴿糞中的酵母菌主要有隱球酵母菌（Cryptococcus）、紅酵母菌（Rhodotorula）、線黑粉酵母菌（Filobasidium）、假絲酵母菌（Candida）、漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces hansenii）和釀酒酵母菌（Saccharomyces）[14]。本研究首次分離了腐熟牛糞中的酵母菌，獲得的酵母菌與上述酵母菌均不相同，這可能與牛糞特殊的營養(yǎng)載體及其所處環(huán)境有關(guān)。本研究中的Trichosporon beigelii和Sporidiobolus johnsonii在腐熟牛糞中占有一定優(yōu)勢，它們可能是牛糞中的優(yōu)勢酵母菌。至于4種牛糞中的酵母菌在牛糞腐熟、發(fā)酵過程中起什么作用、其種群變化趨勢等方面還值得進一步研究。

選取4株酵母菌進行Biolog碳源利用分析發(fā)現(xiàn)，糊精能被所有酵母菌株利用，說明它是牛糞酵母菌的“喜好”性碳源，這可為分離、培養(yǎng)牛糞酵母菌的培養(yǎng)基設(shè)計提供依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)，白吉利毛孢子菌的代謝碳源種類豐富，有L-蘋果酸、D-葡萄糖酸、糊精、反丁烯二酸、龍膽二糖等25種，充分表明該酵母菌具有較強的環(huán)境適應(yīng)性，具有用于生物有機肥開發(fā)利用的潛力;C. tsukubaensis、約翰遜鎖擲孢酵母和伊薩酵母代謝碳源種類較少，這種差異與菌株的代謝能力受到生存環(huán)境的密切影響相關(guān)。此外文獻檢索結(jié)果表明，本研究所得4種牛糞酵母菌均屬于非致病性微生物，安全風(fēng)險低。

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收稿日期：2020-01-20

基金項目：中國博士后科學(xué)基金（編號：2017M610585）;中國煙草總公司科技項目[編號：110202001035（LS-04）];貴州省科技廳優(yōu)秀青年人才培養(yǎng)計劃（編號：黔科合平臺人才[2017]5619）;中國煙草總公司貴州省公司科技項目（編號：201711、201714、201914）。

作者簡介：鄒光進（1968—），男，貴州黔東南人，農(nóng)藝師，主要從事煙草生長管理方面的工作，E-mail：zouguangjin1@163.com;共同第一作者：謝紅煉（1996—），女，湖北黃岡人，碩士研究生，主要研究方向為植物保護學(xué)，E-mail：xiehonglian0901@163.com。

通信作者：汪漢成，博士，研究員，主要從事煙草植物保護學(xué)方面的工作。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com。