大豆GmGolS基因的原核表達及抗旱性分析

邱爽 何佳琦 李銘楊 翟瑩

摘要：肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡稱GolS）是棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡稱RFOs）生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，在植物應(yīng)對非生物脅迫的過程中發(fā)揮著重要作用。通過逆轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR從大豆葉片cDNA中擴增得到編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS，再將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達載體pET28上，然后將載體導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，對其進行異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside，簡稱IPTG）誘導(dǎo)。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE）結(jié)果表明，在誘導(dǎo)時間為3 h、IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下，可以獲得大量重組蛋白，分子量約為40 ku。對表達GmGolS蛋白的大腸桿菌進行抗旱性分析的結(jié)果顯示，GmGolS基因在大腸桿菌中的過表達降低了重組菌的生活力，使其對干旱脅迫更加敏感。

關(guān)鍵詞：大豆;肌醇半乳糖苷合成酶;原核表達;抗旱性

中圖分類號：S565.101?? 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0061-04

植物在遭受不良環(huán)境條件脅迫后，可以誘導(dǎo)自身合成大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來增加植物細胞的滲透壓，提高其抵抗脅迫的能力，從而維持其自身的代謝和生長發(fā)育。棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡稱RFOs）就是這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的典型代表，它們是高等植物中含量僅次于蔗糖的一類可溶性糖。肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡稱GolS）是RFOs生物合成途徑中的關(guān)鍵酶[1]。目前已有大量關(guān)于GolS基因受逆境脅迫誘導(dǎo)表達的報道，且超量或異源表達該基因可以不同程度地提高轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性。擬南芥中含有7種GolS基因，其中AtGolS1、AtGolS2基因可以被干旱、高鹽脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達，AtGolS3基因可以被低溫脅迫誘導(dǎo)上調(diào)表達[2]。在AtGolS1、AtGolS2基因過表達轉(zhuǎn)基因植株中，肌醇半乳糖苷、棉子糖含量均增加，使得植物對氧化脅迫的耐受能力增強[3]。小麥TaGolS3基因的表達受到外源脫落酸（abscisic acid，簡稱ABA）、低溫、鹽脅迫誘導(dǎo)，同時還能被ZnCl2、CuCl2誘導(dǎo)，通過對活性氧的調(diào)控，轉(zhuǎn)基因植株能夠表現(xiàn)出對鋅脅迫的耐受性[4]。GolS基因的抑制表達則使植物對脅迫更加敏感。例如AtGolS1基因的T-DNA插入突變體植株與野生型植株相比，抗熱性明顯降低[5]。GolS基因表達的調(diào)控機制較為復(fù)雜，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種植物轉(zhuǎn)錄因子可以調(diào)控其表達，如HSF、DREB和WRKY等[6-8]。

大豆（Glycine max L.）是世界范圍內(nèi)廣泛種植的經(jīng)濟作物之一，不僅是人類獲取蛋白質(zhì)和脂類的主要來源，同時也是重要的牲畜飼料。大豆中GolS基因的功能鑒定對于大豆棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡稱RFOs）代謝途徑及大豆抗逆機制的研究都具有重要意義。但到目前為止，有關(guān)大豆中肌醇半乳糖苷合成酶的研究非常少。本研究將大豆中1個編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS轉(zhuǎn)化大腸桿菌并進行誘導(dǎo)表達條件的優(yōu)化與抗旱性分析，以期為該基因的功能研究打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本試驗于2018年10月在黑龍江省齊齊哈爾市齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室進行。大豆品種北豆9號、原核表達載體pET28及大腸桿菌DH5α菌株、Rosetta（DE3）菌株均由齊齊哈爾大學(xué)植物分子育種研究室提供。克隆載體pMD18-T、各種限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、DNA marker DL 2000、Ex Taq、RNAiso Plus購自TaKaRa公司;低分子量蛋白marker、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Novoprotein公司;質(zhì)粒提取試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自TIANGEN公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大豆葉片總RNA的提取及cDNA反轉(zhuǎn)錄 使用RNAiso Plus提取0.1 g大豆葉片總RNA，具體操作參照說明書。用瓊脂糖凝膠電泳和D260 nm/280 nm檢測提取的RNA質(zhì)量。使用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成第一鏈cDNA。

1.2.2 目的基因的擴增 在美國國家生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，簡稱NCBI）數(shù)據(jù)庫中搜索編碼大豆GolS基因的序列。利用Primer 5軟件，根據(jù)GmGolS基因的編碼序列設(shè)計引物。上游引物序列為5′-GGAATTCATGGCTCCTAATATCACCACTG-3′，下游引物序列為5′-TGCGGTCGACTTAAGCAGCAGATGGGGC-3′，上游、下游引物序列中的下劃線部分分別代表EcoRⅠ、SalⅠ 酶切位點。以合成的第一鏈cDNA作為模板，PCR擴增GmGolS基因（退火溫度為56 ℃）。將擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的基因片段并連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，經(jīng)質(zhì)粒雙酶切鑒定，挑取陽性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建 將測序正確的含有目的基因的克隆載體擴繁并提取質(zhì)粒，用EcoRⅠ、SalⅠ進行雙酶切，同時將載體pET28用EcoRⅠ、SalⅠ進行雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的片段，通過DNA連接酶將酶切片段定向連接到pET28載體上，再用該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，經(jīng)菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定后，挑取陽性克隆，保存菌種備用。

1.2.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達 挑取pET28-GmGolS陽性克隆和pET28空載體克隆至添加 50 mg/L 卡那霉素和15 mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1 ∶100的體積比轉(zhuǎn)接至20 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至D600 nm為0.4左右時，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalacto pyranoside，簡稱IPTG），分別誘導(dǎo)培養(yǎng)1、2、3、4、5、6 h后，取樣并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱SDS-PAGE），確定最佳誘導(dǎo)時間。使用同樣的方法，分別加入終濃度為0.1、0.2、0.3 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，以確定最佳IPTG誘導(dǎo)濃度。

1.2.5 表達GmGolS蛋白的大腸桿菌干旱脅迫分析 將pET28-GmGolS重組大腸桿菌及含有pET28空載體的大腸桿菌按照優(yōu)化后的最優(yōu)條件（誘導(dǎo)時間為3 h、IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L）進行誘導(dǎo)表達。將誘導(dǎo)后的菌液均稀釋至同一濃度（D600 nm=0.8），各取10 μL，稀釋10 000倍，取 100 μL 分別涂布到不含PEG-8000和含1% PEG-8000的固體LB培養(yǎng)基上（含有50 mg/L卡那霉素、15 mg/L氯霉素），于37 ℃培養(yǎng)12～16 h，觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmGolS基因的克隆

在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索獲得編碼大豆GolS基因的序列GmGolS，其GenBank登錄號為NM001251098。以大豆葉片cDNA為模板，擴增得到987 bp的GmGolS基因全序列（圖1），經(jīng)測序與原序列一致。預(yù)測結(jié)果顯示，GmGolS基因編碼含有328個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量大小為38.03 ku。

2.2 GmGolS基因原核表達載體的構(gòu)建

通過酶切位點將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達載體pET28上，質(zhì)粒雙酶切和菌液PCR結(jié)果見圖2，可見GmGolS基因已成功連接至pET28載體上并獲得了含有重組質(zhì)粒的Rosetta（DE3）菌株。

2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

為了大量獲得GmGolS重組蛋白，對IPTG誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)濃度進行優(yōu)化，結(jié)果（圖3）表明，3～8 泳道與對照（空載體及未誘導(dǎo)菌株）相比，在約 40 ku 處有目的蛋白的表達。GmGolS蛋白分子量為 38.03 ku，加上6個組氨酸標(biāo)簽，融合蛋白分子量約為40 ku，因此表達的重組蛋白大小與預(yù)期結(jié)果相符，但在對照中無此蛋白表達，表明GmGolS基因已經(jīng)在大腸桿菌中成功表達。由圖3還可以看出，IPTG誘導(dǎo)1 h時已出現(xiàn)重組蛋白，隨著誘導(dǎo)時間的延長，重組蛋白的表達量隨之增加，到3 h時達到最大值，之后差別不大。因此，在后續(xù)試驗中將誘導(dǎo)時間設(shè)為3 h。

圖4是在不同IPTG誘導(dǎo)濃度下重組蛋白表達的SDS-PAGE結(jié)果。可以看出，當(dāng)IPTG濃度為01 mmol/L時，重組蛋白的表達量已達到最大值，并且不同濃度間的差別不大。由此可知，不同IPTG濃度在誘導(dǎo)蛋白表達時差異不明顯，IPTG誘導(dǎo)濃度選擇0.1 mmol/L即可。

2.4 表達GmGolS蛋白的大腸桿菌干旱脅迫分析

為了選擇最佳誘導(dǎo)條件，設(shè)IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，對重組菌誘導(dǎo)3 h后進行抗旱性分析。如圖5所示，在未添加PEG-8000的培養(yǎng)基上，與轉(zhuǎn)化空載體pET28的大腸桿菌相比，表達GmGolS蛋白的重組大腸桿菌的生長受到明顯抑制。在含有1% PEG-8000的培養(yǎng)基上，表達GmGolS蛋白的大腸桿菌的生長繼續(xù)受到抑制，雖然含有對照空載體的大腸桿菌生長也受到了抑制，但其活性仍明顯高于表達GmGolS蛋白的大腸桿菌。由此可見，GmGolS蛋白在大腸桿菌中的過表達降低了重組菌的生活力，使其對干旱脅迫更加敏感。

3 討論

肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡稱GolS）催化尿嘧啶二磷酸（uridine diphosphate，簡稱UDP）-半乳糖和肌醇合成肌醇半乳糖苷的反應(yīng)，是棉子糖代謝通路中物質(zhì)合成的第一步，也是棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡稱RFOs）合成的限速步驟[1，9]。越來越多的研究結(jié)果表明，GolS基因在植物的抗逆反應(yīng)、光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)運和種子發(fā)育中發(fā)揮著重要作用[10]。進一步研究GolS基因的表達與GolS酶活性、RFOs的積累及植物抗逆性的關(guān)系，能夠為植物抗逆新品種的培育提供更全面的理論基礎(chǔ)。

大腸桿菌表達系統(tǒng)是目前應(yīng)用最為廣泛的原核表達系統(tǒng)，融合蛋白在該系統(tǒng)中的表達結(jié)果可受多種因素影響，如誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間等[11-12]。本試驗將大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS構(gòu)建到原核表達載體上并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)及條件優(yōu)化（IPTG誘導(dǎo)濃度和誘導(dǎo)時間的優(yōu)化），結(jié)果顯示，該基因能夠在大腸桿菌中表達，融合蛋白分子量大小約為40 ku。但是本研究結(jié)果顯示，IPTG誘導(dǎo)濃度對重組蛋白表達量的影響不大，這與前人的某些試驗結(jié)果相似[13-14]。筆者也嘗試對GmGolS重組蛋白進行純化回收，但表達的重組蛋白主要以包涵體的形式存在（結(jié)果未列出）。推測出現(xiàn)這種情況的原因可能是溫度過高等，使蛋白合成速度過快，導(dǎo)致蛋白質(zhì)來不及進行折疊及二硫鍵的配對，或是由于蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合而使重組蛋白無法達到足夠的溶解度[15-16]。前人曾將木薯、沙冬青的GolS基因在大腸桿菌中進行抗性鑒定，結(jié)果表明，GolS基因過表達的大腸桿菌分別獲得了耐旱性及耐寒性[17-18]。但在本試驗中，GmGolS基因過表達的大腸桿菌干旱脅迫結(jié)果與范潔等的研究結(jié)果[17]不一致，推測可能由于GmGolS重組蛋白在大腸桿菌中的超量表達破壞了大腸桿菌的生理及代謝平衡，導(dǎo)致其對干旱脅迫更加敏感。說明由于表達系統(tǒng)不同，導(dǎo)致部分真核生物的基因不能在原核生物中進行功能鑒定。本研究結(jié)果為進一步的GmGolS蛋白理化性質(zhì)及基因功能研究打下了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究采用RT-PCR方法，從大豆葉片cDNA中擴增得到編碼肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS。再將GmGolS基因構(gòu)建到原核表達載體pET28上，隨后將該載體導(dǎo)入大腸桿菌Rosetta（DE3）中，對其進行IPTG誘導(dǎo)。在誘導(dǎo)時間為3 h、IPTG濃度為0.1 mmol/L的條件下，可獲得大量重組蛋白，相對分子量約為40 ku。對表達GmGolS蛋白的大腸桿菌進行抗旱性分析，結(jié)果顯示，GmGolS基因在大腸桿菌中的過表達降低了重組菌的生活力，使其對干旱脅迫更加敏感。

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收稿日期：2019-11-06

基金項目：黑龍江省普通本科高等學(xué)校青年創(chuàng)新人才培養(yǎng)計劃（編號：UNPYSCT-2017153）;黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費科研項目（植物性食品加工技術(shù)特色學(xué)科專項）（編號：YSTSXK201878）;黑龍江省省屬高等學(xué)校基本科研業(yè)務(wù)費科研項目（編號：135209264）。

作者簡介：邱 爽（1995—），男，山東濟寧人，碩士，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：qs187143@163.com。

通信作者：翟 瑩，博士，副教授，主要從事大豆分子育種研究。E-mail：fairy39809079@126.com。