NCAM2基因的結構、功能及表達調控研究進展

徐子潔 安清明 王大會 賀花 文逸凡 張子敬 王二耀 雷初朝 黃永震

摘要：神經細胞黏附分子2（neural cell adhesion molecule 2，NCAM2）是一類屬于免疫蛋白超家族的細胞黏附分子（CAM），該蛋白與NCAM1是旁系同源，胞外域由5個免疫球蛋白（Ig）模塊和2個纖連蛋白Ⅲ型（FnⅢ）同源模塊組成。多聚唾液酸（polysialic acid，PSA）是NCAM家族中的一種重要修飾，但大部分NCAM為非PSA化。NCAM2在腦組織中高表達，是許多神經發育疾病的關鍵調控候選基因，被認為刺激神經突生長及束縛和抑制突觸成熟等。概述了NCAM2的結構、表達和生物學功能，從癌癥治療、唐氏綜合征等方面介紹NCAM2的作用及研究進展，并對其存在的問題及發展方向提出展望，以期為今后的研究提供參考。

關鍵詞：細胞黏附分子2;多聚唾液酸;生物學功能;研究進展

中圖分類號：Q786?? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0045-05

人神經細胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM）家族主要包含NCAM1和NCAM2，與鈣黏素不同，NCAM是非Ca2+依賴性的細胞黏附分子（CAMs）。近年來，研究提出NCAM家族含有相同的胞外域，5個膜遠端的免疫球蛋白區域和2個纖連蛋白Ⅲ型（FnⅢ）同源區域，NCAM2胞外域通過糖基化磷脂酰肌醇（GPI）或跨膜結構域與細胞質基質連接到質膜上，又被稱為嗅細胞黏附分子（OCAM）和R-8神經細胞黏附分子（RNCAM），是屬于免疫球蛋白家族的細胞黏附分子（CAMs）。NCAM1和NCAM2的胞質結構域、跨膜結構域、胞外結構域的主要結構基本相同，提示兩者結構相關但功能不完全相同。NCAM1早在20世紀70年代就被鑒定出來，而哺乳動物NCAM2的三維模型結構在1997年才出現。雖然是在20年前就發現NCAM2，但相關研究在國內外都還處于初步階段，NCAM2的功能也只是一部分研究的重點。涉及牛腦垂體的相關研究表明，NCAM2對動物育種也有著有不可忽視的作用[1]。本文就NCAM2的結構、表達及生物學功能進行綜述，探究其在畜牧業發展中的作用。

1 NCAM2的結構

1.1 NCAM2的基本結構

Paoloni等提出編碼NCAM2的基因位于染色體21q21，預測NCAM2含有837個氨基酸，通過計算機程序PSORT初步證明跨膜區域主要位于氨基酸殘基702 ～ 718之間[2]。利用核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術和X-Ray技術可以詳細分析NCAM2的三維結構，發現N端5個Ig區域呈線性排列，且在IgⅤ和FnⅢ1以及FnⅢ2之間以不同方式彎曲，利用上述結構模型的模擬可以表明IgⅤ和FnⅢ1之間以及FnⅢ1和FnⅢ2之間的靈活性[3];NCAM1和NCAM2的FnⅢ的結構模型的疊加證明了2種蛋白質及結構域之間的不同角度;NCAM1中非保守氨基酸殘基的單突變導致 FnⅢ1-FnⅢ2 二聚體出現不同的構象[4]。綜上所述及結構模型分析，支持NCAM2中FnⅢ1-FnⅢ2接頭可能也存在靈活性的觀點。NCAM同型具有不同的生物學功能，但這是否因為FnⅢ1-FnⅢ2接頭的靈活變化還不十分清楚，同樣，NCAM2的 IgⅤ-FnⅢ1-FnⅢ2區域功能重要性也有待確定[5]?？梢钥隙ǖ氖?，連接NCAM2同質二聚體的IgⅠ-IgⅡ鏈是NCAM2胞外域中最靈活的結構，推測Ig鏈在二聚體過程中有著重要的作用，但二聚體后靈活性降低，導致膜近端的FnⅢ結構域成為唯一的變化區域。

為進一步確定FnⅢ域的結構和功能，通過對比研究發現，NCAM1和NCAM2的FnⅢ結構域內都包括1個Walker A基序[6]，在NCAM1中ATP與Walker A結合導致NCAM1不能與成纖維細胞生長因子受體（fibroblast growth factor receptor，FGFR）結合，而NCAM2相反，再一次證明了FnⅢ的靈活性。體外重組的NCAM2 FnⅢ結構域與FGFR結合，FnⅢ1-2二聚體通過激活FGFR誘導神經突以濃度依賴性的方式生長，來自NCAM2相似區域的5種多肽中只有2種能通過FGFR依賴的Ras-MAPK通路有效誘導神經突生長，這表明ATP是NCAM2在信號轉導中的配體競爭物，NCAM2可以通過FGFR刺激信號轉導，但其是否通過FGFR或其他生長因子受體發出信號還有待確定。

NCAM2結構模型還包括域交換[7]，指一個模塊的‘Aβ鏈彎曲變成另一模板β-折疊的一部分，含有Ig模塊的蛋白質中域交換是未知的[8]，研究表明，域交換促進受體NCAM2二聚體化[9]。首次觀察到的嗜同性NCAM2相互作用是結晶狀態的 IgⅠ-IgⅠ 鏈，Yoshihara等報道NCAM2介導的細胞-細胞嗜同性反式相互作用是在IgⅠ-IgⅡ相互作用下完成的[10]。有研究指出，蛋白NCAM2通過同源性反式相互作用（NCAM2結合相對細胞表面上的類似NCAM2），或通過嗜異性反式相互作用介導細胞與細胞外基質（ECM）的組分或鄰近細胞的附著;NCAM2還可利用其胞外域與位于同一質膜中的分子順式相互作用，甚至通過其細胞質尾部與胞質蛋白相互作用，從而調節細胞內信號級聯放大機制和細胞骨架的組織。上述結論表明，NCAM2通過同源性或異質性反式相互作用介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質之間的黏附作用，而在同一細胞或質膜上發生同源性或異質性順式相互作用。

1.2 多聚唾液酸糖基化

多唾液酸聚糖（polysialic acid，PSA）是一類由α2，8連接的線性結構的碳水化合物，主要通過 N-連接糖苷鍵附著在NCAM的IgⅤ區域上，PSA由2種α2，8多聚唾液酸轉移酶ST8SiaⅡ（STX）和ST8SiaⅣ（PST）催化形成[11]。NMR技術證明PSA是一種線性的螺旋結構，通過減弱同種細胞或不同細胞NCAM之間的相互作用[12-13]，降低其黏附作用，從而促進神經突向外生長，而PSA在NCAM胞外域的聚糖鏈對細胞識別有重要作用[14]。然而近年研究表明，PSA只附著在人NCAM1上，不與NCAM2連接，盡管NCAM2的Ig結構域上存在8個潛在的N-糖基化位點，提示NCAM2糖基位點存在著其他功能相關的未知修飾。PSA化NCAM高表達在胚胎發育期大腦中，成熟大腦中含量減少，可以推測NCAM1存在于胚胎期而NCAM2可能在發育期或者成熟期含量較多。

廖思明等運用Phyre2軟件構建了精確的ST8SiaⅡ三維模型，提出該酶存在多唾液酸轉移酶結構域（PSTD）和多聚堿性氨基酸區域（PBR）2個重要的功能域[15-16]，并提出功能域內相關氨基酸殘基的敲除對抑制腫瘤細胞的遷移有重要意義。因此，深入研究多唾液酸載體的作用機制對腫瘤抑制物的研發有重大價值。

2 NCAM2的表達及活性控制

NCAM2不僅在哺乳動物中大量表達，而且在脊椎動物中也有表達，但是在無脊椎動物中只表達一種高度相似的NCAM同源物，表明NCAM家族在脊索動物進化過程中由于基因組重復而得以進化[17]。

2.1 NCAM2表達的時期和部位

哺乳動物NCAM2（OCAM/RNCAM）在幾種組織中都有表達，但主要還是在腦中表達較高，其他組織尚不清楚。在大鼠和小鼠上，已經廣泛研究了NCAM2在嗅覺系統中的表達，嗅球位于脊椎動物前腦結構中，嗅覺系統存在廣泛的神經元，NCAM2在發育和成熟的嗅上皮中差異表達，發育中的嗅覺系統，嗅上皮的2，3和4區域以及犁鼻上皮的頂端區域中存在表達NCAM2的感覺神經元的軸突，其與腹側處的NCAM2陰性二尖瓣/簇狀細胞形成突觸，而NCAM2在突觸中累積[18]，由已經在E14的未成熟的二尖瓣/簇狀細胞瞬時表達;而在成人的嗅覺系統中，NCAM2不在二尖瓣/簇狀細胞的樹突中表達，提示NCAM2可能影響突觸成熟。Treloar等提出，NCAM2在二尖瓣/簇狀細胞樹突中的局限表達促進了發育中大鼠的嗅球形成過程，并且指定嗅球在空間上的區域[19]。

2.2 NCAM2表達的基因控制

Nelson等運用信息學的方法在染色體21和22上搜索種間同源區域內STAT5的結合位點簇，鑒定出在NCAM2的調節序列中的第一個內含子區域存在串聯STAT5結合位點，激活態的STAT4和STAT5自發地聚集到NCAM2的調節區，相反，STAT1和STAT3并不結合該區域，因此得出結論：轉錄因子STAT4和STAT5參與調節NCAM2的表達，而STAT1和STAT3無此功能[20]。在人類NK細胞系中，白細胞介素2中NCAM2的表達由激活STAT5的細胞因子誘導，是已知的信號轉導過程中STAT5依賴性信號通路之一。Alenius等培養了過表達GPI錨定的NCAM2或跨膜NCAM2的轉基因小鼠，證明在NCAM2基因的3′端非編碼區中有控制其轉錄穩定性的元件，導致編碼GPI錨定的NCAM2的mRNA沒有編碼跨膜NCAM2的mRNA穩定[21]，這一結果與GPI錨定的NCAM2特異性的表型比跨膜NCAM2更受限制的表達模式這一事實一致。

3 生物學功能

3.1 NCAM2對神經發育的作用

Ichinohe等在成年大鼠的粒狀后軀干皮層中研究了樹突束的發育過程，描述了NCAM2免疫反應區域的形狀，由于該區域出現的時間及獨特的與樹突束互補的定位，猜測NCAM2能有效維持和促進樹突狀區域的形成[22]。但近年來，有研究證明NCAM2表達水平上升導致樹突突起不穩定，且皮層神經元中突起向樹突棘的轉化也減少，NCAM2高表達的神經元聚集在未成熟突觸的蛋白質標記物中。體外生長試驗中，表達NCAM2的嗅上皮外植體比不表達的個體表現出軸突的生長和束縛增加，表明NCAM2在原發性軸突生長束縛中起作用[23]。綜上，提示NCAM2能有效神經突生長與束縛，但不參與突觸的形成過程，并且抑制其成熟，一定程度上影響突觸的可塑性[24]。

NCAM2與嗅覺系統中軸突和樹突的組織有密切關系[25]，對于軸突和樹突區室化的形成和維持也十分重要，同時，已經有報道提出了在粒狀的后軀皮層中表達的NCAM2也具有類似的作用。野生型和NCAM2敲除小鼠的電生理學試驗證明后者的神經活動同步性明顯降低，提示NCAM2敲除的嗅覺系統確實有功能性的改變。同時，研究證明NCAM2通過誘導Ca2+內流和CAMKⅡ活化以促進絲狀偽足和神經突分支的形成[26]。

3.2 NCAM2在腫瘤治療中的研究

癌癥患者病癥的嚴重程度以及治療效果的指標在于腫瘤細胞轉移的發生與否，NCAM2在某些癌癥中過度表達，是一個很好的基因治療靶點。通過對前列腺癌的27種潛在新標志的轉錄水平的研究，包括NCAM2的內含子（POP5），結果表明，POP5可用于前列腺癌的診斷和預后[27]。為研究HER2陽性乳腺癌治療藥物曲妥珠單抗的效率問題，利用mRNA分析揭示了54個差異表達的候選基因，其中NCAM2在曲妥珠單抗治療組中顯著低于未治療的人乳腺導管癌細胞系（BT474細胞系）[28]，提示NCAM2可以作為乳腺癌治療的基因靶點。并且有研究證明，NCAM2是抗體介導的腺病毒載體遞送用于前列腺和乳腺癌細胞感染的有用靶目標。李茂嵐等在國內首次通過全基因組測序來研究膽囊腫瘤組織，確定了轉移性小細胞膽囊神經內分泌癌（GB-SCNEC）的新型生物標志物，指出NCAM2-SGCZ是膽囊癌變中的變化性因素之一，推測NCAM2在其中起著關鍵性作用，對膽囊癌淋巴轉移的治療有重大意義[29]。

3.3 NCAM2在動物育種中的研究

腦垂體是控制生長和發育的關鍵器官，為了解垂體中起作用的分子機制和控制生長的關鍵基因及NCAM2在其中的作用，通過分析文山黃牛和西門塔爾肉牛2個牛品種腦垂體的轉錄譜組，發現細胞黏附因子可以通過細胞-細胞接觸調節垂體激素分泌，間接影響垂體基本功能，而是NCAM2腦垂體分泌途徑中關鍵基因的候選者之一，提示NCAM2在控制生長發育過程中具有一定的調節作用。NCAM家族的分子多樣性于很早以前在斑馬魚中得到驗證，前體分子的PCR結果表明NCAM2首次出現在前腦的特定次級神經元簇中，提示NCAM2在斑馬魚神經系統中功能性神經網絡的形成和維持中具有重大意義[30]。近年來針對NCAM2在動物育種中的研究較少，但作為一個重要的神經分子，對它的進一步了解有利于解決遺傳育種中的難題。

3.4 NCAM2在唐氏綜合征中的研究

研究表明，唐氏綜合征（Downs syndrome，DS）患者的肺和心臟培養物的成纖維細胞比正常對照組聚集得更快，表明細胞之間黏附性增加，這種21三體的成纖維細胞黏附值上升可能是細胞表面大分子數量增加，而這與人NCAM2被認為是劑量平衡的致病物的說法一致，表明由于21號染色體三體性導致的NCAM2表達增加與唐氏綜合征有密切關系。21q22上約4Mb的區域被稱為唐氏綜合征臨界區（Down syndrome critical region，DSCR），研究表明，該區域的3倍性與唐氏綜合征的許多表型相關。雖然NCAM2位于DSCR之外，但已經被提出作為唐氏綜合征發展的候選基因之一[31]。21三體個體中，NCAM2的三拷貝性可能對形態發生和其他生物學現象也有相當大的影響。

3.5 NCAM2的其他功能

基于全基因組關聯研究（GWAS-NR），NCAM2已被提議作為自閉癥的候選基因，研究表明，涉及和指導神經突生長的大部分基因都與自閉癥有關[32]。Scholz等報道了一位自閉癥男孩，他帶有一個復雜的染色體重排和21q21缺失，導致NCAM2缺失[33-34]，提示該基因在神經發育中起到關鍵性作用。

關于阿爾茲海默癥（Alzheimers disease，AD）的發病原理現在仍然知之甚少，Leshchynska等提出突觸喪失是目前比較認可的發病原因之一，人海馬體突觸中富含NCAM2，但這種富集在AD患者的海馬體中被攜帶的致病性人淀粉樣蛋白-β（Aβ）消除，Aβ與體外培養的海馬神經元細胞表面的NCAM2結合，導致NCAM2從突觸中消除，解除富集，正是海馬體中Aβ誘導的NCAM2丟失引發突觸喪失，從而致病[35]。

近年來，研究證明NCAM2還與自殺及哮喘有關，Darlington等通過收集3 000多份自殺死者的DNA樣本發現，與之密切相關基因包括與神經發育及神經信號相關的NCAM2[36]。NCAM2介導的嗜同性相互作用在免疫應答相關的細胞識別過程中可能有重要作用。

4 結論

NCAM2已成為一個相當重要的神經分子，并呈現出多元化的發展前景，其在控制神經突向外生長及束縛、突觸成熟、神經區室化等方面有重要作用，但還有很多問題值得探討，需要進一步完善：（1）NCAM2基因結構的基礎研究有待進一步被發現，例如胞外域的Ig和FnⅢ區域的靈活性與構象改變及功能適應之間的關系尚未清楚;（2）區域接頭的靈活性與NCAM2同型表現出來的不同功能是否有關;（3）NCAM2可以通過FGFR刺激信號轉導，但其是否通過FGFR或其他生長因子受體發出信號還有待確定。

近年來，已經有報道證明NCAM2在多種神經退行性疾病如阿爾茲海默病的形成過程及腫瘤遷移中差異表達，提示NCAM2可以作為重要的基因治療靶點、檢測及預后指標，通過對它的進一步研究可對當前癌細胞的高侵襲高增殖這樣一個臨床上尚未攻克的難題的解決有重要意義;同時，作為控制牛生長發育過程中的重要調節因子，NCAM2作用機制的深入研究與解決動物生長發育緩慢及神經發育異常等疾病有密切關系，有望推動畜牧生產的快速發展，當然在其他未知領域也可能有一定作用。但國內外關于其的研究甚少，就目前來看，NCAM2基因的臨床作用仍需要時間和實踐的檢驗，這將是一項巨大的挑戰。

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收稿日期：2019-08-26

基金項目：國家自然科學基金青年科學基金（編號：31601926）;貴州省銅仁市科技計劃（編號：銅仁科研[2016]18號-5）;貴州省普通高等學校科技拔尖人才支持計劃（編號：黔教合KY字2017-089）;貴州省科技計劃（編號：黔科合支撐2018-1161、2018-2277）;河南省農業科學院自主創新專項基金（編號：2019ZC41）;河南省農業科學院科研發展專項資金（編號：2019CY08）;國家肉牛牦牛產業技術體系專項（編號：CARS-37）。

作者簡介：徐子潔（1999—），女，苗族，貴州銅仁人，主要從事動物遺傳與育種研究。E-mail：xzjsci@126.com。

通信作者：黃永震，博士，副教授，碩士生導師，研究方向為動物遺傳與育種研究。E-mail：hyzsci@nwafu.edu.cn。