干酪乳桿菌LC2W胞外多糖生物合成基因簇啟動子的鑒定

杜心恬， 宋 馨， 劉欣欣， 夏永軍， 艾連中， 熊智強

上海理工大學醫療器械與食品學院， 上海食品微生物工程技術研究中心， 上海 200093

干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是一種常見的益生乳酸菌，廣泛存在于乳制品、自然界和人體中[1]。其中，LC2W是一株高產胞外多糖(exopolysaccharides, EPS)的干酪乳桿菌，其EPS不僅可以作為食品添加劑改變產品質構，也能作為一種“粘性”發酵劑改善產品風味[2]。LC2W的EPS還具有降血壓、腸道菌群維穩和激活免疫應答等益生功效。干酪乳桿菌LC2W中EPS結構解析與產量優化等研究比較深入。例如，AI等完成了LC2W的EPS的分離純化，解析了其結構[3]和生物合成途徑[4]。LI等[2]通過代謝工程方法調控LC2W中EPS合成，使EPS產量提高了75%。

EPS的生物合成一般由eps基因簇控制，包括調控、鏈長、重復單元合成、聚合和輸出等基因[5]。SONG等[6]通過Crispr/Cas9基因編輯技術鑒定出干酪乳桿菌LC2W中3個影響EPS合成的關鍵基因。但LC2W中EPS生物合成研究仍有欠缺，特別是控制轉錄起始及速率的重要元件啟動子尚未鑒定，其轉錄調控亟待研究[7]。生物信息學方法可以利用啟動子保守序列和轉錄調控數據庫信息，預測啟動子位置。RT-PCR[8]和5′-cDNA末端快速擴增技術(5'-RACE)[9]等實驗方法可以鑒定啟動子區域。本研究通過生物信息學方法預測干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇的潛在啟動子區域，利用RT-PCR方法鑒定啟動子，以期為干酪乳桿菌LC2W的EPS合成轉錄調控研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1菌株與質粒

本實驗所用的菌株干酪乳桿菌LC2W由實驗室保藏。

1.1.2試劑與引物

本實驗所用的引物由生工生物有限公司合成(表1)。基因組提取試劑盒購自Axygen；RNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；瓊脂糖購自生工生物有限公司；Phanta超保真DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司； DNA Marker、DNase I(RNA Free)酶試劑盒及反轉錄試劑盒購自Takara。

1.1.3培養基

MRS培養基：用于培養干酪乳桿菌；胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，檸檬酸銨 2 g/L，磷酸氫二鉀 2 g/L，乙酸鈉 5 g/L，硫酸鎂0.2 g/L，硫酸錳0.04 g/L，吐溫80 1 ml/L。固體培養基加瓊脂粉20 g/L。

表1 本研究所用的引物

1.1.4儀器與設備

移液槍，購自Eppendorf公司；冷凍離心機，購自Sigma；超微量核酸蛋白定量儀Nanodrop 2000，購自Thermo Fisher；PCR儀、電泳儀和凝膠成像儀，購自Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1基因組抽提

挑取平板劃線的干酪乳桿菌LC2W單菌落于MRS液體培養基中活化12 h，以2%的比例接種于5 mL MRS液體培養基，37 ℃靜置培養12 h～16 h后，離心收集菌體。根據Axygen基因組提取試劑盒說明書步驟操作，提取LC2W基因組。

1.2.2RT-PCR鑒定共轉錄單元

將干酪乳桿菌LC2W液體培養至對數生長期，收集菌體，按照天根RNA提取試劑盒說明書步驟操作提取RNA。通過Takara反轉錄試劑盒合成cDNA，利用cDNA在相鄰的基因間隔區進行PCR，篩選干酪乳桿菌eps基因簇中的共轉錄單元。

以干酪乳桿菌LC2W的DNA、RNA和cDNA為模板，分別與eps基因簇上的所有基因間隔區的引物orf2169-orf2170-F/R、orf2170-orf2171-F/R、orf2171-orf2172-F/R、orf2172-orf2173-F/R、orf2173-orf2174-F/R、orf2174-orf2175-F/R、orf2175-orf2176-F/R、orf2176-orf2177-F/R、orf2177-orf2178-F/R、orf2178-orf2179-F/R、orf2179-orf2180-F/R、orf2180-orf2181-F/R、orf2181-orf2182-F/R、orf2182-orf2183-F/R、orf2183-orf2184-F/R、orf2184-orf2185-F/R、orf2185-orf2186-F/R、orf2186-orf2187-F/R、orf2187-orf2188-F/R、orf2188-orf2189-F/R、orf2189-orf2190-F/R共21對引物進行PCR擴增，其中DNA組為陽性對照，RNA組為陰性對照，cDNA組為實驗組。

PCR擴增反應為50 uL體系(表2)，擴增程序如下：94 ℃ 2 min；98 ℃ 10 s；Tm(引物退火溫度)30 s；68 ℃，1 min/kb，循環30次；68 ℃ 10 min。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，篩選共轉錄單元，鑒定啟動子區域。

表2 PCR反應體系

2 結果與討論

2.1 生物信息學方法預測eps基因簇啟動子區域

干酪乳桿菌LC2W前期已完成基因組全測序，將干酪乳桿菌LC2W預測的eps基因簇與乳酸菌中參與EPS生物合成的已知基因進行比對，發現LC2W中eps基因簇由21個基因組成(圖1)，且預測得到該基因簇的各基因功能[6](表3)。

eps基因簇通常以多個共轉錄單元組成，啟動子通常位于基因轉錄起始位點上游的非編碼區，自身不轉錄mRNA[10]。通過對eps基因簇上的共轉錄單元進行篩選，可以確定啟動子存在的位置[8]。啟動子存在于每個轉錄單元的轉錄起始位點上游，利用NCBI ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測LC2W中eps基因簇操縱子和CDS(基因編碼區)，推測潛在啟動子區域(表3)。由于LC2W_2171-LC2W_2175基因功能不明，所以暫未列入預測。結果顯示LC2W中eps基因簇預測存在5個操縱子，其余皆為單基因轉錄單位(圖1)。結合基因功能預測結果，通過生物信息學方法分析共得到8個潛在啟動子區域，分別命名為P2169-2170、P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184、P2185-2186、P2187-2188、P2189-2190。(圖1)

注：操縱子區域為同色系，單基因轉錄單元為獨立色系。圖1 干酪乳桿菌LC2W中預測的eps 基因簇及啟動子預測

表3 干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇中操縱子的預測

2.2 RT-PCR鑒定eps基因簇啟動子區域

為驗證上述生物信息學的預測，因共轉錄單元mRNA的連續性，設計了22對基因間隔區間的引物，通過RT-PCR分析證實eps基因簇上的潛在共轉錄單元。若cDNA與引物的PCR產物有條帶，則相鄰基因共轉錄，一般不存在啟動子；若無條帶，則相鄰基因獨立轉錄，是潛在啟動子區域。其中，DNA組為陽性對照，RNA組為陰性對照。

RT-PCR結果表明(圖2)，干酪乳桿菌LC2W的eps基因簇中存在5個操縱子，其余2個基因皆為單基因轉錄單位。基因簇上存在個6個啟動子區域，分別為P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190。與生物信息學方法預測的結果相比，有5個潛在啟動子區域P2179-2180、P2180-2181、P2182-2183、P2183-2184和P2187-2188不存在啟動子結構，而P2169-2170、P2185-2186、P2189-2190是3個正確的啟動子。此外，基因簇上發現了3個未被預測到的啟動子P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176。不同細菌啟動子基因的差異性會影響預測結果，這可能是造成本研究通過RT-PCR鑒定得到的啟動子與生物信息學預測結果不同的重要原因[11]。

3 結論

本研究通過生物信息學分析干酪乳桿菌LC2W的eps基因簇，通過基因功能和操縱子的預測分析，推測出8個潛在啟動子區域。利用RT-PCR方法篩選eps基因簇中的共轉錄單元，鑒定出6個啟動子區域P2169-2170、P2172-2173、P2174-2175、P2175-2176、P2185-2186、P2189-2190，與預測結果略有差異。啟動子是基因表達調控網絡的關鍵元件，本研究干酪乳桿菌LC2W中eps基因簇啟動子的鑒定，對后續EPS生物合成轉錄調控機理研究提供幫助。