基于單克隆抗體的雙酚A間接競爭酶聯免疫分析法的建立

張玉超，劉旭東

（1.茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷564507；2.茅臺學院食品科學與工程系，貴州仁懷564507）

作為生產聚碳酸酯和環氧樹脂的重要原料，雙酚A（bisphenol A，BPA）的使用量逐年升高[1-2]。隨著這些材料的廣泛使用，特別是在食品行業中的使用，BPA遷移后可通過生物鏈進入生物體。作為一種典型的環境內分泌干擾物，BPA可通過干擾內分泌功能對生物體產生生殖發育毒性、神經毒性、致癌性等多種毒性作用[3-5]。因此，BPA殘留量的檢測對于控制BPA的環境暴露量，保護人類健康和生態環境有重要意義。

目前國內外對于BPA的檢測基本采用儀器分析法，這些檢測方法依賴價格昂貴的檢測設備，例如高效液相色譜儀、氣相色譜儀、質譜儀等，操作和樣品前處理復雜，且不能同時對大量樣品進行檢測[6-7]。酶聯免疫分析法（enzyme-linked immunoassay，ELISA）依賴高特異性的抗體，利用抗原-抗體特異性反應，很好地彌補了儀器分析法的不足[8-9]。本研究以制備BPA單克隆抗體為基礎，構建一種BPA的間接競爭ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）檢測方法，為 BPA ELISA檢測技術發展提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPF級6～8周齡雌性BALB/c小鼠：湖北省疾病預防控制中心實驗動物中心；Sp2/0細胞：武漢大學保藏中心。

BPA、雙酚酸（4，4-bis（4-hydroxyphenyl）valeric acid，BVA）、牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）、N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、1-乙基-3-（3-二甲基胺丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3-（3-dimethyllaminopropyl）carbodiimide hydrochloride，EDAC）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）：國藥集團藥業股份有限公司；福氏完全佐劑（Freund′s complete adjuvant，FCA）、福氏不完全佐劑（Freund′s incomplete adjuvant，FICA）：Sigma-Aldrich公司。以上試劑均為分析純。

包被緩沖液：0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，pH7.4）；抗體稀釋液：含0.1%BSA的PBS；封閉液：3%脫脂奶粉溶液；洗滌液：含0.05%吐溫-20 的 PBS；終止液：2 mol/L H2SO4。

DMEM培養基、HAT培養基、HT培養基：Thermo公司。

1.2 儀器與設備

S-3100型紫外分光光度計：Scinco公司；ELX800型酶標儀：Bio-tek公司；5415R型低溫冷凍離心機：Eppendorf公司；BB15型CO2恒溫細胞培養箱：Thermo公司；TS2-FL型倒置顯微鏡：Nikon公司。

1.3 BPA人工抗原合成

以BVA作為半抗原與BSA、OVA分別進行偶聯，制備完全抗原BVA-BSA、BVA-OVA。在文獻的基礎上進行改進[10]，取 0.9 mg BVA、2.98 mg NHS、4.56 mg EDAC溶于 300 μL DMF 中，17 ℃，130 r/min，避光反應 16 h，得到溶液A。將12 mg BSA和12 mg OVA分別溶于2 mL pH9的PBS中，得到溶液B。將溶液A逐滴加入溶液B中，攪拌均勻后25℃左右下避光反應12 h，得到溶液C。將溶液C在6 000 r/min離心5 min，取上清液裝入透析袋置于pH7.4，0.01mol/L的PBS中，4℃透析至少48 h，每隔12 h換液1次。對所得的人工抗原進行紫外掃描確定偶聯是否成功，-20℃保存備用。

1.4 免疫BALB/c小鼠

對BALB/c小鼠進行頸背部皮下多點人工抗原免疫（BVA-BSA 或 BVA-OVA 100 μg溶解于 100 μL pH7.4的PBS中，與等體積的FCA或FICA混合），按表1的免疫方案進行免疫[11]。

表1 免疫方案Table 1 The immunization protocol

1.5 抗血清效價和靈敏度的測定

第4次免疫7 d后，對免疫的小鼠進行斷尾取血，對抗血清的效價和靈敏度分別采用間接ELISA（indi rect noncompetitive ELISA，inELISA）和間接競爭ELISA（indirect competitive ELISA，icELISA）進行測定[12]。免疫原為BVA-OVA的小鼠抗血清進行ELISA測定時使用1.0 mg/mL BVA-BSA作為包被原，免疫原為BVABSA的小鼠抗血清使用1.0 mg/mL BVA-OVA作為包被原。選擇抗血清效價和靈敏度都很高的小鼠作為細胞融合中脾細胞的供體。

1.6 單克隆抗體的制備和純化

在細胞融合前3 d，對小鼠進行200 μg免疫原腹腔注射（加強免疫），取脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在聚乙二醇作用下進行細胞融合，在HAT培養基中培養，記錄有融合細胞的孔，待細胞克隆長至板底約1/10時，用icELISA對細胞培養上清液進行檢測，選取特異性最好的陽性細胞孔進行有限稀釋。將HAT培養基換成HT培養基，陽性細胞至少進行3次克隆化，使得陽性率達到100%后換DMEM培養基擴大培養建立細胞株。取10周齡BALB/c小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，10 d后腹腔注射狀態良好的雜交瘤細胞株（1×106個～2×106個），10 d后無菌操作收集小鼠腹水，采用辛酸-硫酸銨法純化[12]。

1.7 包被抗原濃度和抗體稀釋比的確定

將包被原稀釋至 1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，4 ℃包被過夜，將BPA單克隆抗體按照1∶8 000、1∶16 000、1 ∶32 000、1 ∶64 000、1 ∶128 000、1 ∶256 000、1 ∶512 000的體積比進行倍比稀釋，進行方陣滴定[13]。選取OD450值大約為1的組合進行icELISA測定，選擇IC50值最小的組合作為最佳包被抗原濃度和抗體稀釋比組合。

1.8 間接競爭ELISA法條件優化

在最佳包被抗原濃度和抗體稀釋比下對反應體系中有機溶劑的種類及含量、pH值、溫度、封閉劑進行優化。分別使用5%、10%、15%、20%、25%的DMSO、DMF、甲醇、乙腈配制BPA標準溶液，進行icELISA，計算各反應條件下的IC50，選取IC50值最小的條件進行后續條件的優化。采用同樣的方法對競爭反應體系pH值（6.4、7.4、8.4、9.4）、反應溫度（4、25、30、37 ℃）、封閉劑（1%BSA、1%OVA、1%明膠、3%脫脂奶粉）進行優化，選擇IC50最小的條件作為BPA檢測icELISA法的最優條件。

1.9 BPA檢測間接競爭ELISA法標準曲線的建立

根據所建立的icELISA檢測方法，采用不同濃度的 BPA 標準溶液（0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、200 ng/mL）與BPA單克隆抗體競爭，以抑制率為縱坐標，Lg（10×CBPA）為橫坐標繪制標準曲線，并計算IC50。

1.10 交叉反應率的測定

采用1.9所述方法，將BPA標準液換成BPA類似物雙酚S、BVA、對苯二酚、鄰羥基苯甲酸標準品，進行IC50的測定，計算交叉反應率CR，CR/%=BPA的IC50/BPA 類似物 IC50×100。

1.11 加標回收率的測定

利用去離子水將BPA配制成濃度為2.5、5、10、25、50、100 ng/mL的加標水樣，采用icELISA法測定水樣中BPA含量，計算加標回收率/%=實際測得的BPA濃度/BPA標準濃度×100。

1.12 數據處理

試驗數據用SPSS 13.0進行分析，以平均值±標準差形式呈現；以GraphPad Prism 5.0進行制圖。

2 結果與分析

2.1 BPA人工抗原的合成

BVA與BSA和OVA通過活性酯法偶聯后，BVA、BSA、OVA、BVA-OVA和BVA-BSA的紫外掃描結果如圖1、2所示。

圖1 BVA、OVA、BVA-OVA紫外掃描圖Fig.1 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，OVA，BVA-OVA

圖2 BVA、BSA、BVA-BSA紫外掃描圖Fig.2 Ultraviolet absorbance spectra of BVA，BSA，BVA-BSA

結果顯示BVA在220 nm～290 nm范圍內有強吸收峰，在275nm處出現了最高吸收峰；OVA在215nm和270 nm處有最強吸收峰；BVA-OVA在220 nm～300 nm范圍內有強吸收峰，在290 nm附近有最強吸收峰，BVA-OVA體現了BVA和OVA的吸收特征，且最大吸收峰波長出現了一定的紅移，又顯示出自身的特性，因此可以判斷BVA和OVA偶聯成功。BVA和BSA偶聯情況和上述類似，可以判斷BVA和BSA偶聯成功。

2.2 抗血清效價和靈敏度的測定

免疫周期完成以后，對各免疫小鼠抗血清的效價和靈敏度進行測定，結果如表2所示。

結果顯示，BVA-BSA作為免疫原顯示出了比較高的靈敏度（IC50低），但是總體效價偏低，而BVA-OVA作為免疫原，特別2號小鼠產生的抗血清具有高效價（>256 000）和高靈敏度（IC50＜221 ng/mL）。所以2號小鼠選擇作為脾細胞供體制備雜交瘤細胞。

表2 抗血清效價和靈敏度Table 2 Titers and sensitivity of antisera

2.3 雜交瘤細胞的篩選

雜交瘤細胞的篩選結果見表3。

經細胞融合，篩選到6株陽性細胞株，其中3A11細胞株隨BPA競爭濃度的增加OD450顯色程度下降明顯，說明其可分泌對BPA親和力較高的單克隆抗體。此細胞株被選擇用于采集腹水，收集到的腹水采用辛酸-硫酸銨法純化。

表3 雜交瘤細胞的篩選Table 3 Screening of hybridoma cells

2.4 icELISA法的建立

方陣滴定的結果顯示，在包被抗原的質量濃度和抗體稀釋倍數為 1 μg/mL、256 000，0.5 μg/mL、128 000，0.25 μg/mL、64 000，0.25 μg/mL、32 000，0.125 μg/mL、32 000時OD450值大約為1。對以上幾種組合的靈敏度進行測定，結果見表4。

表4 最適包被抗原質量濃度和單克隆抗體稀釋倍數組合的IC50值Table 4 IC50for screening of optimal coating concentration and diluted multiples of monoclonal antibody

表4的結果顯示，包被抗原的質量濃度為1μg/mL，抗體稀釋倍數為256 000時IC50最低，且抗體稀釋度最大，因此選擇此組合作為最適包被抗原質量濃度和抗體稀釋倍數組合。

競爭反應體系中有機溶劑的種類和濃度、競爭反應體系pH值、競爭反應體系溫度以及封閉劑的種類對icELISA的影響如圖3～6所示。

圖3 有機溶劑對icELISA的影響Fig.3 Influence of organic solvents on icELISA

圖4 pH值對icELISA的影響Fig.4 Influence of pH on icELISA

圖5 反應溫度對icELISA的影響Fig.5 Influence of temperature on icELISA

圖6 封閉劑對icELISA的影響Fig.6 Influence of blocking agents on icELISA

結果顯示，反應體系中添加15%的DMSO，體系pH值為7.4，溫度為25℃，并采用1%OVA作為封閉劑icELISA的靈敏度最高。因此優化的icELISA反應條件為：以1 μg/mL的BVA-BSA為包被抗原，BPA單克隆抗體稀釋倍數為256 000倍，競爭反應體系添加15%的DMSO，pH7.4，25℃，以1%OVA作為封閉劑。

2.5 BPA icELISA檢測標準曲線的構建

按照icELISA的檢測條件，利用BPA不同濃度的標準品構建的檢測標準曲線見圖7。

圖7 BPA icELISA檢測標準曲線Fig.7 Standard curves of BPA by icELISA

標準曲線在0.5 ng/mL～50 ng/mL范圍內顯示出了良好的線性關系，IC50值為16.65 ng/mL，檢測下限IC10為0.5 ng/mL。

2.6 交叉反應率測定

利用本研究所得的單克隆抗體與BVA、雙酚S、對苯二酚和鄰羥基苯甲酸進行icELISA，計算IC50，結果如表5所示。結果顯示4種BPA類似物的交叉反應率均非常小，說明本研究所得到的BPA單克隆抗體特異性好。

表5 交叉反應率Table 5 Cross-reactivity of the assay

2.7 水樣中加標回收率測定

水樣中加標回收率的結果如表6所示，結果顯示BPA的加標回收率為89.72%～105.25%。

表6 水樣中BPA加標回收率Table 6 Recovery rate of BPA in water

3 結論與討論

BPA在人類生活中有著廣泛的應用，由于可以遷移到食品和周圍環境中，且具有多種毒性，特別是內分泌干擾作用，對人和動物的健康具有嚴重危害。目前BPA儀器分析法存在很多的不足，而ELISA檢測法很好地彌補了儀器分析法的不足。

由于BPA屬于小分子化合物，只具有反應原性無免疫原性，所以需要合成大分子的人工抗原進行免疫。本研究選用BPA結構類似物BVA作為半抗原，引入了3個直鏈碳原子連接臂和羧基，通過碳化二亞胺法將BVA與BSA、OVA偶聯，合成人工抗原BVABSA和BVA-OVA。以往的研究認為BSA由于具有很多優點，是制備人工抗原的首選蛋白載體[14]。而在本研究中，BVA-BSA免疫的所有小鼠抗血清對于BPA有著較好的特異性，但是效價很低；而BVA-OVA免疫的小鼠中則出現了特異性和效價都很高的個體，而在后期的icELISA方法構建中，選擇BVA-BSA作為包被原體現出了很好的靈敏度。說明選擇以何種蛋白質作為載體蛋白需要通過最終的免疫效果來確定。

傳統的制備抗體的免疫方案是在第一次免疫時將抗原與等體積的FCA混勻注射，隨后每2～4周換用抗原與等體積的FICA混勻注射進行加強免疫[15-16]，此種方法獲得高效價的抗體周期長，一般需要3個月左右。本研究依據前期研究，在第3天重復第1次免疫，在第28天換用FICA進行免疫，在第49天再進行加強免疫，采用4次免疫篩選出血清效價和特異性較高的小鼠，縮短了免疫周期。并采用聚乙二醇法進行細胞融合，經過3次篩選，成功獲得一株分泌抗BPA單克隆抗體的細胞株。

ELISA反應受多種因素影響，在建立ELISA檢測方法前需要對反應體系的包被抗原濃度和抗體工作濃度、有機溶劑種類和含量、反應溫度、pH值、封閉劑種類等條件進行優化[17-20]，從而提高檢測的靈敏度。本研究中以IC50作為不同條件下icELISA的判斷標準，確立了基于BPA單克隆抗體的icELISA方法，該檢測方法檢測下限IC10為0.5 ng/mL，IC50值為16.65 ng/mL，水樣中加標回收率為89.72%～105.25%。

本研究構建了基于BPA單克隆抗體的icELISA檢測方法，該方法與傳統的儀器分析法相比具有快速、簡便、靈敏等優點，可用于BPA殘留量的檢測，具有良好的應用前景。