MS培養(yǎng)基中氮、磷無機(jī)鹽對鰻草克隆幼苗生存的影響

張 飛，鄭鳳英

（山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院，山東威海 264209）

0 引言

MS 培養(yǎng)基是1962 年Murashige 和Skoog 專為煙草細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)計(jì)的培養(yǎng)基，其大量元素中的氮以NH4NO3(1650 mg/L)和KNO3(1900 mg/L)兩種形式添加、磷以KH2PO4(170 mg/L)形式添加[1]。MS 培養(yǎng)基是目前組織培養(yǎng)中最常用的培養(yǎng)基之一[2]，其特點(diǎn)是無機(jī)鹽濃度較高，特別是硝酸鹽含量高，適合組織和細(xì)胞的長期培養(yǎng)，也被用作一些植物的水培液[3-4]，它還是海草組織培養(yǎng)的試用培養(yǎng)基之一[5-9]。

海草是沉水生活于海洋的高等植物，全球僅有72種，具有重要的生態(tài)價(jià)值[10-11]。與陸生植物、甚至淡水生植物相比，海草的室內(nèi)長期培養(yǎng)和組織培養(yǎng)研究嚴(yán)重滯后。盡管學(xué)者們曾對多種海草進(jìn)行了室內(nèi)人工培養(yǎng)研究[5-9,12]，但僅有小型海草川蔓草(Ruppia maritima)[7]和毛葉喜鹽草(Halophila decipeins)[11]的室內(nèi)無菌長期培養(yǎng)獲得了成功，在這些研究中，培養(yǎng)基中氮的添加形式及氮、磷的濃度都是研究者關(guān)注的重點(diǎn)。鰻草(Zostera marina)屬于大型海草，其室內(nèi)人工培養(yǎng)及組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展更為緩慢[8,13-15]。因此，本研究在添加MS 培養(yǎng)基氮、磷無機(jī)鹽的天然海水中，室內(nèi)培養(yǎng)了鰻草新生克隆幼苗，比較不同氮、磷無機(jī)鹽濃度對其活力和葉綠素含量的影響，以期為鰻草的室內(nèi)培養(yǎng)和組織培養(yǎng)技術(shù)的攻克提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

室內(nèi)試驗(yàn)于2018 年4—5 月在山東大學(xué)（威海）海洋學(xué)院海草組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 克隆苗采集與緩苗

2018年4月下旬于威海市雙島灣海域采集返青生長旺盛、健康的鰻草克隆片段植株，就地清洗后裝入盛有海水的塑封袋內(nèi)迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。在室內(nèi)從鰻草克隆片段上摘取PI=8～9（根狀莖3 節(jié)+5～6 片葉、枝長約為15 cm、至少2 簇根，根長約3～5 cm）的克隆幼苗[16]，置于天然海水中緩苗3 天，期間培養(yǎng)條件為：溫度15℃、光量子密度60 μmol/(m2·s)、光周期12 L:12 D。

1.3 室內(nèi)培養(yǎng)方法

緩苗期結(jié)束后，將克隆幼苗置于300 mL的組培瓶（瓶中盛有添加氮、磷無機(jī)鹽的天然海水250 mL），并于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周，培養(yǎng)密度為2株/瓶，培養(yǎng)條件為：溫度15℃、光量子密度60 μmol/(m2·s)、光周期12 L:12 D。氮、磷無機(jī)鹽添加共設(shè)計(jì)12 個(gè)處理：在天然海水中單獨(dú)添加MS 培養(yǎng)基中的大量無機(jī)鹽KH2PO4、NH4NO3和KNO3，其中，KH2PO4和NH4NO3均設(shè)置3個(gè)濃度梯度，分別為MS培養(yǎng)基中各自濃度的1/2 倍、1 倍和2 倍（即1/2 MS、MS 和2 MS 培養(yǎng)基中2 種無機(jī)鹽的濃度）；KNO3設(shè)置4 個(gè)濃度，分別為MS 培養(yǎng)基中KNO3濃度的1/2 倍、1 倍和2 倍及MS 培養(yǎng)基中NO3-總濃度(39.4 mmol/L)；同時(shí)設(shè)置2 個(gè)對照：天然海水和天然海水+MS培養(yǎng)基1倍的NH4NO3、KNO3和KH2PO4（見表1）。每處理設(shè)置10 個(gè)重復(fù)。每日觀察克隆苗的生長狀態(tài)、特別是葉片和根的褐變情況，于第7 天后從每瓶中隨機(jī)取1 株先對其形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行觀察記錄，隨后對各處理的葉片葉綠素含量進(jìn)行測定。其余幼苗繼續(xù)培養(yǎng)，14天后對各處理組剩余植株進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征的觀察記錄和葉片葉綠素含量的測定。

表1 各處理組中氮、磷無機(jī)鹽的添加情況

1.4 形態(tài)學(xué)評價(jià)指標(biāo)

主要形態(tài)學(xué)指標(biāo)包括根生長點(diǎn)活力、根狀莖生長點(diǎn)活力、新發(fā)葉片數(shù)和葉片褐化比例。根、根狀莖生長點(diǎn)活力主要關(guān)注其褐變情況和變質(zhì)情況；新發(fā)葉片數(shù)為露出葉鞘的新葉數(shù)；每株植株的葉片褐化比例采用目測法來估計(jì)。

1.5 葉片葉綠素含量測定

將葉片洗凈后120℃殺青，于80℃烘干，研磨成粉末，得到葉粉（密閉貯存）。稱取葉粉1 g（精確至0.001 g）放入小燒杯中，加入15～20 mL 95%乙醇浸提，并隨時(shí)攪動。待浸提液呈深綠色時(shí)，濾出浸提液，殘?jiān)?0 mL 95%乙醇復(fù)洗，一同過濾于小燒杯中。采用分光光度計(jì)法[17]分別測定D663和D645，葉綠素濃度(mg/g·DW)計(jì)算公式分別為(1)～(3)。

式(1)～(2)中，V為浸提液的總體積(mL)，M為稱取的葉粉重量(g)，D663、D645分別為葉綠體色素溶液在波長663、645 nm 處的光密度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)都在SPSS 17.0軟件中進(jìn)行，以單因素方差分析法對不同處理間葉綠素含量進(jìn)行組間差異分析。單因素方差分析方差齊性時(shí)，采用LSD檢驗(yàn)比較分析組間差異；方差不齊時(shí)，采用Dunnett’s T3進(jìn)行組間差異的多重比較。以P＜0.05作為差異顯著水平，P＜0.01 為差異極顯著水平。數(shù)據(jù)整理和繪圖在Excel 2013中完成，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)誤來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同無機(jī)鹽對鰻草葉綠素含量的影響

培養(yǎng)7天后，對照1組（天然海水）中的鰻草克隆苗葉片的葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總量分別為0.43±0.03、0.21±0.01、0.63±0.05 mg/g（見表2）。單獨(dú)添加KNO34 個(gè)處理組的葉綠素含量與對照1 組無顯著差異；而單獨(dú)添加KH2PO43 個(gè)處理組的葉綠素含量較低，1/2 倍、1 倍和2 倍處理組葉綠素總量分別為0.46±0.03、0.43±0.06、0.46±0.05 mg/g，顯著低于對照1 組和單獨(dú)添加KNO34 個(gè)處理組的葉綠素總量(P＜0.05)，它們分別為對照1 組的73%、68%、73%；單獨(dú)添加NH4NO33 個(gè)處理組和對照2 組的葉綠素含量均極顯著低于對照1 組和單獨(dú)添加KNO3的4 個(gè)處理組(P＜0.01)、顯著低于單獨(dú)添加KH2PO4的3個(gè)組(P＜0.05)，其中，1/2倍、1倍、2倍處理組和對照2組的葉綠素總量分別為0.15±0.02、0.15±0.01、0.13±0.02、0.17±0.01 mg/g，僅分別為對照1 組的23%、23%、20%和27%（見表2）。同一無機(jī)鹽不同濃度添加量之間的葉綠素含量均無顯著差異，對照2組和單獨(dú)添加NH4NO3的3個(gè)處理組之間也無顯著差異（見表2）。

同培養(yǎng)7天一樣，培養(yǎng)14天的同一無機(jī)鹽不同濃度添加量（1/2 倍、1 倍和2 倍）之間的葉綠素含量均無顯著差異，對照2組和單獨(dú)添加NH4NO3間也無顯著差異（見表2）；葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總量仍然以添加KNO3者含量最高、對照1組次之、添加NH4NO3者最低。培養(yǎng)14 天后，單獨(dú)添加KNO3的4 個(gè)處理的葉綠素含量比7天時(shí)略有升高，但升高幅度不顯著，1/2倍、1倍、2倍處理組和1倍NO3--N組的葉綠素總量分別為0.65±0.04、0.69±0.04、0.64±0.07、0.62±0.07 mg/g；單獨(dú)添加KH2PO4的3 個(gè)處理組14 天后的葉綠素含量較培養(yǎng)7 天時(shí)明顯降低(P＜0.05)，1/2 倍、1 倍和2 倍處理組葉綠素 總 量分別為0.26±0.02、0.22±0.02、0.22±0.02 mg/g，3個(gè)葉綠素指標(biāo)值的下降率均在50%左右；單獨(dú)添加NH4NO3的3 個(gè)處理和對照2 組14 天后的葉綠素含量比培養(yǎng)7 天時(shí)均顯著降低(P＜0.05)，1/2 倍、1倍和2 倍處理組葉綠素總量分別下降了60%、47%和53%，對照2組同比時(shí)間則下降了47%。

2.2 不同無機(jī)鹽對鰻草形態(tài)與生長的影響

單獨(dú)添加KNO34 個(gè)處理組中的鰻草克隆幼苗均能健康生長，根、根狀莖2 個(gè)生長點(diǎn)有活力，葉片褐化比例最低，在14 天后平均褐化率僅為22%，屬老葉自然衰老褐化，并有新葉發(fā)出；對照1 組幼苗的根、根狀莖生長點(diǎn)在培養(yǎng)過程中均健康，葉片也為自然衰老褐化，但無新葉發(fā)出；單獨(dú)添加NH4NO3的3 個(gè)處理組中的鰻草幼苗從第3天（48 h后）起葉片便開始褐化，至7天時(shí)褐化比例高達(dá)80%，莖尖和根尖已明顯變軟，并開始褐化，14天后植株完全褐化死亡；對照2組的克隆苗形態(tài)和存活狀況均與單獨(dú)添加NH4NO3者相近，14 天后葉片褐化率達(dá)95%，根、根狀莖生長點(diǎn)均無活力，整個(gè)培養(yǎng)期間無新葉發(fā)出；單獨(dú)添加KH2PO4的3個(gè)處理組的幼苗在培養(yǎng)7天后根、根狀莖生長點(diǎn)仍健康，但葉片褐化比例已達(dá)40%，14 天時(shí)葉片褐化率增至56%，根生長點(diǎn)和根狀莖生長點(diǎn)仍健康，但無新葉發(fā)出。

表2 培養(yǎng)7天和14天后不同處理?xiàng)l件下鰻草葉片的葉綠素含量 mg/(g·DW)

表3 培養(yǎng)7天和14天后不同處理?xiàng)l件下鰻草克隆幼苗形態(tài)與生長情況對比

3 討論

海草的葉片和根可分別吸收海水和沉積物間隙水中的氮、磷營養(yǎng)鹽[18]。海草生長海域沉積物間隙水中的NH4+、NO3-+NO2-和PO43-的濃度范圍分別為0.8～180、2.2～10、0.3～20 μmol/L，而海水中三者的濃度范圍分別是0～3.2、0.05～8、0.1～1.7 μmol/L[19]，即沉積物間隙水中的氮、磷營養(yǎng)鹽濃度明顯高于海水中的氮、磷營養(yǎng)鹽濃度。研究顯示，海水中NO3-濃度為35 μmol/L便可影響鰻草的正常生長[20]，而施肥處理的沉積物間隙水中20 mmol/L的NO3-才是鰻草的耐受閥值[21]；雖然鰻草的葉片對海水中NO3-的耐受力遠(yuǎn)低于根對沉積物中NO3-的耐受力，但海草葉片的營養(yǎng)吸收能力卻高于根部，如鰻草葉片對氮的吸收量占植株總氮吸收量的60%～70%[22]。本研究中，在NO3-濃度高達(dá)39.4 mmol/L的環(huán)境下，鰻草克隆苗并未出現(xiàn)生長抑制現(xiàn)象，培養(yǎng)14 天后生長健康，并有新葉發(fā)出。本研究為純液體培養(yǎng)，鰻草根、葉處在同一高濃度NO3-環(huán)境中，有可能為根部解除了原位沉積物中缺氧、NO3-的有效性低以及NH4+-N有效性會抑制NO3-的吸收等多項(xiàng)限制因素[21]，從而表現(xiàn)出了高的NO3-吸收和利用率。但究竟是根、還是葉在NO3-的吸收中起主要作用，仍值得進(jìn)一步研究。

雖然鰻草等海草能同時(shí)吸收利用NO3--N和NH4+-N，并且以NH4+-N為主[18,23]，但NH4+-N濃度高時(shí)會產(chǎn)生銨鹽毒害，如Van Katwijk等用4個(gè)不同NH4+濃度處理的人工海水培養(yǎng)鰻草，結(jié)果顯示NH4+濃度為125 μmol/L時(shí)，2 周后鰻草葉片開始褐化；濃度為25 μmol/L 和75 μmol/L時(shí)，5周后植株也開始褐化；只有9 μmol/L是安全濃度[24]。MS 培養(yǎng)基中的NH4+濃度高達(dá)20.6 mmol/L，所以在本研究中，1/2 MS、MS和2 MS培養(yǎng)基中的NH4+濃度對鰻草克隆苗均有較強(qiáng)的毒害作用，3 個(gè)濃度的毒害表現(xiàn)在48 h 后即可從葉片的褐化現(xiàn)象上觀察到，7天后莖尖和根尖已明顯變軟、并開始褐化，植株基本死亡。這也說明即便環(huán)境中有NO3--N存在時(shí)（對照2組的NO3--N和NH4+-N摩爾濃度比為1:1.9；3 個(gè)NH4NO3處理組二者的濃度比均為1:1），鰻草克隆苗仍會優(yōu)先選擇高濃度的NH4+-N 作為主要的無機(jī)氮源。因此在離體培養(yǎng)鰻草克隆幼苗時(shí)，可以考慮單獨(dú)添加NO3--N、或者以高濃度NO3--N+低濃度NH4+-N為培養(yǎng)基的主要氮源添加形態(tài)，也即不應(yīng)將NH4+-N作為惟一的氮源。

本研究結(jié)果顯示，1/2 MS、MS和2 MS培養(yǎng)基中的KH2PO4(0.625～2.5 mmol/L)濃度同樣對鰻草的克隆苗有毒害作用，但PO43-對克隆苗的毒性明顯比其中的NH4+-N 要輕許多，它主要傷害葉片，對莖尖和根尖生長點(diǎn)幾乎無傷害，而NH4+-N 3個(gè)處理組的濃度均使克隆苗的2個(gè)生長點(diǎn)在7天時(shí)即開始壞死。目前尚未見有關(guān)磷酸鹽對海草毒害的報(bào)導(dǎo)，有關(guān)磷酸鹽含量對海草生長發(fā)育的影響研究也較為少見。曾有學(xué)者在對海草的磷酸鹽吸收動力學(xué)進(jìn)行研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)海草對PO43-的吸收親合力與NH4+處在相同的數(shù)量級[18]，而且提高磷酸鹽濃度可以促進(jìn)海草對氮的同化作用，進(jìn)而有助于提高海草對高濃度氮的耐受性[21]。但本研究在單獨(dú)添加高濃度PO43-時(shí)，鰻草的克隆幼苗僅出現(xiàn)比單獨(dú)添加NH4+時(shí)較輕毒害作用的現(xiàn)象，同時(shí)在對照2 組中添加較高磷元素含量時(shí)，也未發(fā)現(xiàn)克隆苗對高濃度氮的耐受作用。此外值得注意的是，本研究是在不考慮天然海水背景氮、磷無機(jī)鹽的影響的條件下進(jìn)行的，而不論氮元素還是磷元素的單獨(dú)添加，可能都會導(dǎo)致克隆苗的生長受到氮元素或是磷元素的限制。本研究采樣點(diǎn)所屬的雙島灣海域氮、磷營養(yǎng)結(jié)構(gòu)特征為磷限制[25]，因此在單獨(dú)添加PO43-處理組時(shí)，鰻草克隆幼苗的生長受磷元素限制可能有所解除，從而表現(xiàn)出比單獨(dú)添加NH4+較輕的毒害作用。但有關(guān)PO43-及其與NH4+或NO3-協(xié)同的毒害作用與機(jī)理仍有待進(jìn)一步研究。

但也有研究顯示，1/2 MS 或MS 培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽在海草的離體培養(yǎng)或小型海草的植株無菌培養(yǎng)中并不產(chǎn)生毒害，如Koch 和Durako 用添加了1/2 MS 培養(yǎng)基無機(jī)鹽和激素、蔗糖等物質(zhì)的液體培養(yǎng)基對川蔓草莖尖進(jìn)行了成功的無菌離體培養(yǎng)，并實(shí)現(xiàn)了該種的莖尖離體快速繁殖[7]，但當(dāng)培養(yǎng)基中的蔗糖被碳酸氫鹽替代時(shí)，1/2 MS液體培養(yǎng)基中的川蔓草便無法生存[9]；Loques 等用多種培養(yǎng)基對大洋波喜蕩草(Posidonia oceanica)的莖尖進(jìn)行了離體無菌培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)無機(jī)元素配方與MS培養(yǎng)基相同的LS培養(yǎng)基效果最好，30天后莖尖存活率高達(dá)94%，存活期可長達(dá)123天，培養(yǎng)27天時(shí)葉綠素含量顯著高于White 培養(yǎng)基組和Heller培養(yǎng)基組[6]；Kiyasu和Hirata用MS固體培養(yǎng)基成功以鰻草莖尖為外植體誘導(dǎo)出了愈傷組織[5]。由此筆者推測雖然海草植株生長時(shí)對氮、磷的需求水平低于MS 培養(yǎng)基的供給量，但離體培養(yǎng)時(shí)對氮、磷無機(jī)鹽的需求往往較大，MS 培養(yǎng)基在特定環(huán)境中是其離體培養(yǎng)的安全培養(yǎng)基，其生理機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

天然海水中單獨(dú)添加KNO3為氮源、添加NO3-濃度在9.8～39.4 mmol/L（即1/2 MS、MS 和2 MS 培養(yǎng)基中的KNO3和MS培養(yǎng)基中總NO3-濃度）時(shí)，培養(yǎng)14天后鰻草克隆苗未表現(xiàn)出任何毒害現(xiàn)象，葉綠素含量與天然海水對照組無顯著差異(P＞0.05)，且有新葉發(fā)出；在天然海水中單獨(dú)添加1/2 MS、MS和2 MS培養(yǎng)基中的NH4NO3和KH2PO4，克隆苗培養(yǎng)7 天后葉綠素總量分別僅為天然海水對照組的20%～27%和68%～73%，且NH4NO3處理組從48 h起葉片開始褐化，7天后褐化比例高達(dá)到80%以上，根尖和莖尖已明顯變軟并開始褐化，14 天后植株全部死亡；KH2PO4處理組的克隆苗在培養(yǎng)14 天后，根尖和根狀莖雖健康，但葉片平均褐化率已達(dá)56%。同一無機(jī)鹽不同濃度處理?xiàng)l件下培養(yǎng)7天和14天，克隆苗葉綠素含量均無顯著差異，對照2組（天然海水+MS培養(yǎng)基1倍的NH4NO3、KNO3和KH2PO4）和單獨(dú)添加NH4NO3的3 個(gè)組之間也無明顯差異。

室內(nèi)培養(yǎng)鰻草克隆幼苗時(shí)，MS 培養(yǎng)基中的NH4NO3和KH2PO4即便減半量添加均有毒害作用，且NH4NO3的毒害作用大于KH2PO4；但MS 培養(yǎng)基中的KNO3對克隆苗卻未表現(xiàn)出毒害。因此1/2 MS 和MS培養(yǎng)基均不適用于鰻草的室內(nèi)長期培養(yǎng)，其室內(nèi)培養(yǎng)建議以單獨(dú)添加的NO3--N、或是以高濃度NO3--N+低濃度NH4+-N作為培養(yǎng)基的主要氮源添加形態(tài)。