常見殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力效應

林天然 ，盧藝惠，曾文龍，林曉路，賴榮泉，湯鳴強,4，彭水連

（1福建省煙草公司龍巖市公司，福建龍巖 364000；2福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建福清 350300；3福建農林大學植保學院，福州 350003；4現代設施農業福建省高校工程研究中心，福建福清 350300；5龍巖市煙草公司長汀分公司，福建長汀 366300）

0 引言

由青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)感染導致的煙草青枯病是世界性重要土傳病害之一。該病菌廣泛分布于熱帶、亞熱帶和溫帶地區，防治難度大，給煙草生產帶來了極大的威脅[1]。近年來，隨著氣候變化的加劇，煙田環境青枯病的發生也愈加頻繁，發病的范圍也愈加廣泛[2]。國內外學者對煙草青枯病的防治開展了廣泛的研究，主要方向涵蓋了農業防治、抗病品種選育[3]、化學防治[4]、生物防治[5]和基因工程等方面，取得了較大的進展[6]。目前，國內化學防治仍是控制煙草青枯病的主要技術手段[7-8]。尚志強[9]采用20%青枯靈400～600 倍液、200 g/mL 農用鏈霉素灌根取得較好的防治效果。龔廣生等[10]研究應用200 U的鏈霉素或者葉青雙可濕性粉劑500 倍液灌根，煙草青枯病可得到有效控制。為篩選出有效防治煙草青枯病的藥劑，筆者采用平板抑菌圈法測定硫酸鏈霉素、乙蒜素、辛菌胺醋酸鹽、克菌康、青枯靈5種殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力作用，并通過先接種病原后灌藥處理的溫室盆栽試驗檢測其藥效。在此基礎上采用不同作用機制殺菌劑復配，研究其復配增效作用，以期為煙草青枯病的高效化學防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試病原菌與煙草品種 煙草青枯病菌XQ23菌株分離自福建龍巖上杭廬豐煙田土壤，分離菌株于25%甘油中，-80℃保存。供試煙草品種為‘云煙87’，由福建省煙草公司龍巖市分公司提供。

1.1.2 培養基

（1）NA 培養基。葡萄糖10 g/L，蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，酵母膏0.5 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0。

（2）TTC 培養基。將上述NA 培養基融化并冷卻至50℃，加入TTC使其終濃度為50 mg/L。

1.1.3 供試藥劑72%農用硫酸鏈霉素可濕性粉劑，重慶豐化科技有限公司；1.8%辛菌胺醋酸鹽AS，山東勝邦綠野化學有限公司；3%克菌康WP，廈門凱立生物制品有限公司；50%青枯靈可濕性粉劑，山東金山生物工程有限公司；80%乙蒜素，河南科邦化工有限公司。

1.1.4 主要儀器P402N電子天平，上海精密科學儀器有限公司；GSP-9050MBE隔水式恒溫培養箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠；AB204-E酸度計，上海雷磁儀器廠；7200型分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙草幼苗培育 將‘云煙87’的包衣種子放入培養皿萌發2 天，然后將幼苗移栽于裝有草炭和蛭石的塑料盆內，每盆4株，置于溫度為28～32℃溫室內培育，幼苗生長45天后備用。

1.2.2 供試藥劑對煙草青枯病菌EC50的測定與比較 取1 mL 經活化的青枯病菌懸液（濃度108cfu/mL）于平皿，倒入NA 瓊脂培養基混和均勻并凝固。將蘸有供試藥液的圓形濾紙片等距放置于平板上（表1），每處理3 個重復，以無菌水為對照。將平板置28℃恒溫培養36 h，用十字交叉法測量抑菌圈直徑，根據農藥室內生物測定數據處理系統軟件計算5種殺菌劑對煙草青枯病病菌的抑制中濃度EC50和相關系數r，通過EC50值比較供試殺菌劑對煙草青枯病菌的抑菌效果[11]。

1.2.3 不同殺菌劑復配的聯合毒力測定 根據各殺菌劑單劑的毒力測定結果，選取效果較好且殺菌機理不同的青枯靈與農用硫酸鏈霉素進行復配。以青枯靈為標準藥劑將2 種殺菌劑按照1:1、1:3、3:1 的體積比混合配制成復配劑，按照1.2.2的方法測定復配劑對煙草青枯病菌的抑菌效果，并采用孫云沛（1960）方法計算共毒系數(CTC)[12]。若CTC≥120 表示增效作用；CTC≤80，表示拮抗作用；80＜CTC＜120，表示相加作用。

表1 供試藥劑的濃度梯度 mg/L

1.2.4 5 種殺菌劑的盆栽藥效試驗 將6 葉煙苗移栽于花盆中并緩苗1 周，在煙株根部周圍劃入土壤中使煙株一部分支根斷掉，將配制好的青枯病菌菌懸液（濃度1×108cfu/mL）從劃入的部位灌入，每盆煙苗30 mL，再等量灌入72%農用硫酸鏈霉素可濕性粉劑1500倍液、50%青枯靈400 倍液、80%乙蒜素200 倍液、1.8%辛菌胺醋酸鹽100 倍液和3%克菌康800 倍液殺菌劑，以等量清水處理作為空白對照。將施藥后的花盆置人工氣候箱中培養（溫度(28±1)℃，相對濕度95%）。盆栽試驗施藥1 次，每個處理設3 組重復，每組重復10 株煙苗。定義施藥當天為施藥0天，每隔7天進行一次染病情況調查。施藥28 天后按照式(5)～(7)計算青枯病的發病率及病情指數[13]。

1.2.5 調查統計 于2016 年7 月10 日調查防治效果。小區調查采用全面普查法進行，按各分級標準記載各小區的發病情況，統計病情級數，計算病株率、病情指數和防治效果。煙草病情分級標準參照中華人民共和國煙草行業標準YC/T 39—1996《煙草病害分級及調查方法》進行[14]。

1.2.6 數據處理與分析 用Excel 2003 和SPSS 15.0 軟件對數據進行單因素方差分析，各處理間的顯著差異采用單因素方差分析(ANOVA)評價，平均值多重比較采用最小顯著極差法，顯著水平為0.05，數據用平均值±標準差表示[15]。

2 結果與分析

2.1 不同殺菌劑對煙草青枯病菌的室內毒力

EC50是各殺菌劑毒力大小的重要衡量指標之一，毒力越大則EC50越小。試驗結果（表2）表明，5種殺菌劑對煙草青枯病菌的室內毒力由大到小為青枯靈＞農用硫酸鏈霉素＞辛菌胺醋酸鹽＞克菌康＞乙蒜素。毒力回歸方程斜率是病菌對藥劑劑量變化的反應速率，可以看出在各殺菌劑的不同稀釋倍數下，煙草青枯病菌對青枯靈和農用硫酸鏈霉素有較高的敏感性。實踐中要將藥劑對病原菌的EC50值和毒力回歸方程的斜率結合，才能比較科學地評價各殺菌劑的室內毒力測試結果。

2.2 殺菌劑復配對煙草青枯病菌的毒力

根據單劑毒力的測定結果，選取青枯靈與農用硫酸鏈霉素進行復配，考察2 種殺菌劑不同體積比復配下對煙草青枯病菌的毒力效應，研究其協同增效作用。試驗結果（表3）表明，青枯靈與農用硫酸鏈霉素的復配體積比為1:1 和3:1 情況下，共毒系數分別為43.89和28.15，均遠小于100，為拮抗作用；而青枯靈與農用硫酸鏈霉素的復配體積比為1:3 時，共毒系數為148.48，其值大于100，表現為增效作用。

表2 不同殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力測定結果

2.3 不同殺菌劑對煙草青枯病的溫室盆栽試驗

由圖1可知，供試的5種殺菌劑對煙草青枯病都有一定的防治效果，而且均能夠拖延青枯病的發病時間。從3 次用藥調查結果看，50%青枯靈處理能夠顯著降低煙草青枯病的發病率，其防效達(88.6±3.91)%，其次是農用硫酸鏈霉素和辛菌胺醋酸鹽處理，防效分別為(56.7±5.42)%、(75.6±1.98)%。5 種殺菌劑中防效較差的是克菌康和乙蒜素，兩者的防效相當，沒有顯著性差異。

3 結論與討論

青枯雷爾氏菌(Ralstonia solanacearum)寄主范圍廣泛，可侵染54科450多種植物[16]。有研究表明，該菌的初次侵染以作物根際土壤為主，帶菌土壤是青枯病的主要病源，預防青枯菌的侵入是青枯病防治的關鍵[17]。目前，對煙草青枯病的防控主要集中在抗病育種、農業防治、化學防控和生物防治等方面。化學防控可以推遲發病高峰期、降低危害，最大限度地降低煙葉生產的經濟損失，但對煙草青枯病防控的有效藥劑十分缺乏，因此篩選有效的藥劑防治并進行毒力測定是一項重要內容。

化學藥劑的處理方式包括噴霧、灌根和浸種等方式，實踐上為更好地模擬煙草青枯病菌在土壤中的自然分布狀態以及對煙苗的自然侵染方式，多采用蘸根法（灌根法）進行煙草青枯病菌的接種[18]。何永宏等[19]研究發現，煙草青枯病菌對‘云煙87’的侵染閾值為3×102cfu/mL。為提高致病效果，本試驗采用的接菌濃度為1×108cfu/mL，以避免因土壤吸附對病菌侵染閾值的影響。

殺菌劑對病原菌的EC50值常是衡量殺菌劑對病原菌抑制作用的重要指標，可為藥劑進行田間或保護地的實際藥效試驗提供參考。EC50值越小，說明供試藥劑對病菌的抑制效果越好，在實際應用中對病菌的防治效果可能就越好[20]。本試驗采用經典抑菌圈法研究5種殺菌劑對煙草青枯病菌的毒力效應。試驗結果表明，72%農用硫酸鏈霉素、80%乙蒜素、1.8%辛菌胺醋酸鹽、3%克菌康、50%青枯靈EC50分別為43.50、154.69、116.75、123.43、37.86 mg/L，對煙草青枯病菌的室內毒力由大到小為青枯靈＞農用硫酸鏈霉素＞辛菌胺醋酸鹽＞克菌康＞乙蒜素，試驗結果與黃保宏[21]、賈春燕[22]田間防治藥劑篩選結果基本一致。同時也說明5種殺菌劑對煙草青枯病菌的生長均有抑制作用，而且殺菌劑濃度與抑菌效應呈現顯著的正相關關系。

盆栽試驗設計有藥劑浸種、先灌藥后接種病原和先接種病原后灌藥等處理方式。本試驗采用噴霧法施藥，盡管5種殺菌劑的作用機理及其特性各不相同，它們對煙草青枯病都有一定的防治效果，其中以50%青枯靈和72%農用硫酸鏈霉素效果最佳。青枯靈是一種高效、中等毒性的有機硫殺菌劑，廣泛用于農作物白葉枯病、青枯病的防治，效果良好。不少研究證實，農用硫酸鏈霉素是抑制多種作物病原細菌的有效藥劑，也是防治青枯病菌的首選藥物[21-27]，實踐中通過浸種、灌根預防或者治療等方式取得較好的防效。

化學藥劑的長期頻繁單一使用導致病原菌對化學農藥的抗性日益提升，使得化學農藥的防治效果明顯降低。將不同作用機理的殺菌劑進行合理復配，不僅減少了化學藥劑的使用量，降低了農戶的用藥成本，對環境也更加安全、友好，同時也延緩了病原菌對現有藥劑抗性的產生，可謂是一舉多得。本試驗將青枯靈與農用硫酸鏈霉素按照體積比1:1、3:1 和1:3 進行復配。試驗結果表明，當二者的復配體積比為1:1和3:1情況下，呈現拮抗作用；而復配體積比為1:3 時，表現為增效作用。對于復配增效作用機理的解釋，研究者有不同的觀點，但多數認為通過復配，一種藥劑的藥效作用加強了另外一種藥劑對病原菌的藥效作用，導致產生增效作用。由于本試驗只是初步篩選，尚缺乏田間試驗驗證，因此其增效機制和聯合作用方式等有待于深入研究和探索。