基于UPLC指紋圖譜的厚樸藥材去粗皮質(zhì)量評價研究

李燕珍 魯云 陳丹燕

[摘要] 目的 研究厚樸藥材、去粗皮厚樸與厚樸粗皮主成分的含量和指紋圖譜差異，為厚樸藥材去粗皮入藥提供依據(jù)。 方法 采用Waters Acquity UPLC BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），以乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫35℃，檢測波長230 nm。對不同產(chǎn)地厚樸藥材、去粗皮厚樸與厚樸粗皮進行厚樸酚、和厚樸酚的含量測定，對比其共有峰的峰面積，并進行相似度分析。 結(jié)果 厚樸酚、和厚樸酚的總含量均為去粗皮厚樸>厚樸藥材>厚樸粗皮;去粗皮厚樸6個共有峰的峰面積均比厚樸藥材、厚樸粗皮的峰面積高。結(jié)論 厚樸去粗皮可提高厚樸飲片的質(zhì)量，為厚樸去粗皮提供實驗參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 厚樸藥材;去粗皮厚樸;厚樸粗皮;指紋圖譜;相似度

[中圖分類號] R282 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）07（a）-0027-04

[Abstract] Objective To study the content of main components and fingerprint differences of officinal magnolia bark， removing rough bark of officinal magnolia bark， rough bark of officinal magnolia bark， and provide evidence for the used as medicine of removing rough bark of officinal magnolia bark. Methods Waters Acquity UPLC BEH-C18 column （50 mm×2.1 mm， 1.7 μm） was used as the column. Acetonitrile-0.2% phosphoric acid solution was used as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 0.4 mL/min， column temperature was 35℃， and the detection wavelength was 230 nm. The contents of magnolol and honokiol were determined for officinal magnolia bark from different areas， removing rough bark of officinal magnolia bark， rough bark of officinal magnolia bark. The peak area of the common peak was compared， and the similarity was analyzed. Results The total contents of magnolol and honokiol was removing rough bark of officinal magnolia bark>officinal magnolia bark>rough bark of officinal magnolia bark. The peak area of 6 common peaks of removing rough bark of officinal magnolia bark was higher than that of officinal magnolia bark and rough bark of officinal magnolia bark. Conclusion It can improve the quality of officinal magnolia bark pieces and provide experimental reference for removing rough bark of officinal magnolia bark.

[Key words] Officinal magnolia bark; Removing rough bark of officinal magnolia bark; Rough bark of officinal magnolia bark; Fingerprint; Similarity

厚樸始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，為木蘭科植物厚樸Officinal magnolia bark或凹葉厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils. var. biloba Rehd. et Wils.的干燥干皮、根皮及枝皮。厚樸具有燥濕消痰、下氣除滿的功效[2]。厚樸產(chǎn)于湖北、四川等地，習(xí)稱“川樸”，凹葉厚樸主要分布在浙江、福建、湖南南部等地，商品習(xí)稱“溫樸”[3]。相關(guān)文獻(xiàn)報道[4-5]厚樸的主要化學(xué)成分有木脂素類、苯乙醇苷類、生物堿類以及揮發(fā)油等。現(xiàn)代藥理證明，厚樸具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化等多種藥理作用[6-7]。傳統(tǒng)加工炮制過程中，皮類飲片多需除去外表粗皮，歷代古籍皆有記載，如《本草綱目》記載“凡入藥去粗皮”[8]。宋代《太平惠民和劑局方》亦云“凡使，先刮去粗皮，令見赤心”[9]，明代《醫(yī)學(xué)入門》載“……如不去皮，耗人元氣”[10]。《中華人民共和國藥典》[11]2015年版一部厚樸飲片炮制項下也規(guī)定：厚樸需刮去粗皮。現(xiàn)代生產(chǎn)則簡化工序，多不去皮。厚樸作為常用大宗藥材，需求量很大，因此對厚樸飲片的質(zhì)量控制尤為重要。目前，關(guān)于厚樸去粗皮化學(xué)成分的研究多集中在厚樸酚與和厚樸酚的含量變化上[12-14]，未見對其他成分影響的報道。本研究通過測定厚樸藥材、去粗皮厚樸及厚樸粗皮的厚樸酚、和厚樸酚的含量與指紋圖譜，對厚樸去粗皮前后成分進行進一步研究，為保證藥效及用藥的安全性，保證厚樸藥用的科學(xué)合理性提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters H-class超高效液相色譜儀、TUV檢測器、Empower工作站（沃特世公司）;Milli-QDirect超純水系統(tǒng)（默克股份有限公司）;ME204E型萬分之一天平（METTLER TOLEDO公司）;KQ-500E超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;ST16高速離心機（賽默飛世爾有限公司）。

1.2 材料

甲醇、乙腈（色譜純，默克股份有限公司）;水（超純水，默克股份有限公司）;厚樸酚對照品（批號：110729-201714，純度：100%）、和厚樸酚對照品（批號：110730-201614，純度：99.3%）均購自中國食品藥品檢定研究院。10批厚樸藥材來源信息見表1，經(jīng)過廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為木蘭科植物厚樸Cortex Magnoliae Officinalis。

表1 ? 厚樸藥材信息

2 方法與結(jié)果

2.1 UPLC指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件 ?色譜柱：Waters Acquity UPLC BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動性：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～2 min，9%～11%A;2～5 min，11%～12%A;5～8 min，12%～15%A;8～10 min，15%～39%A;10～13 min，39%～60%A;13～18 min，60%～65%A;18～24 min，65%～96%A;24～25 min，96%～100%A。柱溫：35℃;流速：0.4 mL/min;檢測波長：230 nm[15]。進樣量：1 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 ?取厚樸酚、和厚樸酚對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每mL含厚樸酚33 μg、和厚樸酚45 μg的混合對照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 ?取厚樸藥材、去粗皮厚樸及厚樸粗皮粉末（三號篩）約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，搖勻，密塞，稱定重量，冷浸24 h，稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，13 000 r/min（半徑7 cm）離心10 min 后取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜，濾過，即得。

2.1.4 專屬性試驗 ?取對照品溶液、空白甲醇溶劑及供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別測定。結(jié)果顯示，空白溶劑在對照品溶液色譜峰相應(yīng)位置無吸收，空白溶劑無干擾，方法專屬性良好。

2.1.5 線性關(guān)系考察 ?精密稱取對照品適量，按“2.1.2”項下制成濃度為228.1 μg/mL的厚樸酚、濃度為221.6376 μg/mL的和厚樸酚對照品母液。精密量取對照品母液0.05、0.50、2.70、3.50 mL分別置于5 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別將稀釋后不同濃度的對照品溶液以及對照品母液按“2.1.1”項下色譜條件檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以進樣濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程。厚樸酚Y1 = 2.0685X1+1.9423（r1 = 0.9999），濃度范圍為2.3～228.1 μg/mL;和厚樸酚Y2 =1.1249X2+1.3829，（r2 = 0.9999），濃度范圍為2.216 376～221.637 600 μg/mL。厚樸酚、和厚樸酚在以上濃度范圍內(nèi)進樣濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.1.6 加樣回收率試驗 ?取已知含量的厚樸藥材粉末，精密稱定，按對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比0.5∶1、1∶1、1.5∶1加入和厚樸酚與厚樸酚對照品，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率，回收率均為94.21%～105.54%，回收率良好。

2.1.7 精密度試驗 ?取厚樸藥材粉末約0.3 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進行測定，重復(fù)進樣6次，記錄色譜圖。計算各共有峰峰面積的RSD均<0.57%，提示儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗 ?取厚樸藥材粉末約0.3 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖。計算各共有峰峰面積的RSD均<2.48%，提示方法的重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗 ?取厚樸藥材粉末約0.3 g，精密稱定，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，室溫放置，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、4、8、12、16、20、24 h 進樣測定，記錄色譜圖。計算各共有峰峰面積的RSD均<3.16%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.10 共有峰的確定 ?取“2.1.3”項下制備的供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件檢測，記錄色譜圖，分別將其導(dǎo)入國家藥典委員會中國色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版），以S1圖譜作為參照，采用中位數(shù)法，經(jīng)多點校正后，進行色譜峰的匹配，生成指紋圖譜共有模式，標(biāo)定共有峰6個。10批厚樸藥材指紋圖譜共有峰模式見圖1，厚樸藥材、厚樸粗皮和去粗皮厚樸的對照指紋圖譜。見圖2。

2.1.11 指紋圖譜相似度分析 ?采用國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版），建立共有模式作為對照指紋圖譜，將各批厚樸藥材指紋圖譜與對照指紋圖譜比較，計算10批厚樸藥材的相似度，其范圍為0.849～0.969，提示不同產(chǎn)地的厚樸藥材其化學(xué)成分受產(chǎn)地、環(huán)境等因素的影響存在一定差異。將同一批次厚樸藥材、去粗皮厚樸與厚樸粗皮的指紋圖譜，建立共有模式作為對照指紋圖譜，進行相似度分析，見表2，相似度極高，提示三者間的化學(xué)成分在種類上無顯著差別。

2.2 厚樸藥材、去粗皮厚樸和厚樸粗皮樣品中兩種酚類成分的含量比較及粗皮比例

10批厚樸藥材的粗皮所占比例為5%～10%[粗皮比例（%）=粗皮重量/藥材重量×100]。厚樸藥材、去粗皮厚樸與厚樸粗皮兩種酚類成分分布規(guī)律均為去粗皮厚樸>厚樸藥材>厚樸粗皮，與文獻(xiàn)[12]報道結(jié)果一致。去粗皮厚樸兩種酚總量的均值約為藥材的1.7倍。去粗皮厚樸兩種酚總量的均值約為粗皮的19倍。

2.3 指紋圖譜共有峰的峰面積比較

比較同一批去粗皮厚樸與厚樸藥材的共有峰峰面積，結(jié)果見表4。比較同一批去粗皮厚樸與厚樸粗皮的共有峰峰面積，結(jié)果見表5。（例：以干燥品計算，供試品中峰1的峰面積=峰1峰面積的實測值/取樣量;S1峰1峰面積的比值=去粗皮厚樸峰1的峰面積/厚樸藥材峰1的峰面積;峰1峰面積比值的均值=10批峰1峰面積的比值相加/10）。去粗皮厚樸與厚樸藥材各共有峰峰面積比值的均值為2.25～5.72。去粗皮厚樸與粗皮各共有峰峰面積比值的均值為5.47～49.47。表4～5結(jié)果顯示，去粗皮厚樸6個共有峰的峰面積均高于藥材、粗皮。

3 討論

中藥包含的成分復(fù)雜多樣，除了對其主要成分進行含量測定外，還要通過指紋圖譜或特征圖譜等進行多組分的研究分析，從而更能體現(xiàn)藥材質(zhì)量的整體性[16-20]。實驗結(jié)果顯示，厚樸藥材、去粗皮厚樸與厚樸粗皮的化學(xué)成分無顯著差別，但兩種酚類成分含量均存在明顯差異，去粗皮厚樸兩種酚的含量較藥材及粗皮高;特征圖譜中，去粗皮厚樸6個共有峰峰面積的比值的均值均高于藥材及粗皮。且厚樸外皮有粗糙的木栓層，隨著生長年限的延長，厚樸粗皮更為明顯[12]，有時還附著較多不潔物，遠(yuǎn)達(dá)不到中藥飲片的凈度要求。厚樸去粗皮不僅可以提高飲片的潔凈度，還能提高飲片的質(zhì)量。提示厚樸去粗皮有一定的科學(xué)依據(jù)。

目前，關(guān)于厚樸去皮問題的現(xiàn)代研究尚缺乏系統(tǒng)性，大多研究僅著手于化學(xué)成分、藥效學(xué)評價等內(nèi)容[21]。鑒于中藥在臨床上的療效是多種成分綜合作用的結(jié)果，僅從化學(xué)成分的角度來確定厚樸是否去粗皮似有不足。尚需從本草考證、化學(xué)成分研究、藥效學(xué)評價、安全性評價和采收加工炮制等方面綜合考慮，為厚樸是否去粗皮提供更科學(xué)的依據(jù)。

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（收稿日期：2019-11-21）