淺談精氨酸在蛋白復性中的作用

呂娜

摘要：重組蛋白通常在細菌中以不溶性包涵體的形式表達，精氨酸常被用于透析或稀釋重折疊蛋白質的溶劑中，精氨酸能增加蛋白質分泌到周質的產量，并增強蛋白質在儲存期間的穩定性。精氨酸這些作用都是源于精氨酸能夠抑制蛋白質聚集。

關鍵詞：精氨酸;蛋白復性;蛋白聚集

1 概述

異源蛋白質在大腸桿菌表達時經常形成包涵體（IBs），因此需要將重組蛋白回收后重折疊成有活性的結構。精氨酸廣泛用于包涵體重新折疊獲得的蛋白質溶劑中[1]，并且對多種化學和物理性質不同的蛋白質有效，精氨酸能通過透析或者稀釋誘導蛋白質的重折疊，并且在不溶性蛋白質的重折疊時也使用精氨酸。

2 精氨酸對蛋白質的一些影響

精氨酸對蛋白質具有多種作用。這里我們主要總結了精氨酸在蛋白質折疊，對不容顆粒的增容和蛋白質聚集的影響。這些作用表明精氨酸有助于抑制蛋白質聚集。

2.1 體內和體外重組蛋白質重新折疊

當含有二硫鍵的異源蛋白質在大腸桿菌的細胞質中表達時，不利的細胞環境中不能形成正確的二硫鍵，無法形成可溶性功能蛋白，只能形成膜包裹的高密度、不溶性蛋白質顆粒，即包涵體[2]。包涵體不具有生物學活性，形成比較復雜，胞質內蛋白質生成速率快，新生多肽濃度高，無充足的時間進行折疊等都有關系，此外，與宿主菌的培養條件，如培養基成分、溫度、pH值、離子強度等因素都會造成包涵體的形成。具有生物學活性蛋白質常以可溶性或分子復合物的形式存在，功能性的蛋白質總是折疊成特定的三維結構型。在體外蛋白質的重折疊中經常使用0.1—2.0M精氨酸溶劑（pH8.0—8.5），精氨酸的作用已經在其他免疫球蛋白和幾種白細胞介素蛋白折疊中得到印證[3]。光譜分析不溶性蛋白的重折疊證明了控制耦合氧化型谷胱甘肽和精氨酸的作用導致逐步透析完全重折疊。除此之外精氨酸重折疊解決方案似乎打斷了形成二硫鍵并保持具有游離巰基的部分折疊多肽的溶解度。

2.2 精氨酸對不溶性顆粒的增容

在大腸桿菌中表達時，大多數含二硫鍵的蛋白質形成堅固的包涵體。然而，不需要二硫鍵折疊的蛋白質（例如自然表達的細胞內蛋白質）可以在大腸桿菌細胞質中表達為可溶性蛋白質。相反，表達的蛋白質通常分布在可溶性部分和不溶性顆粒中，或僅在不溶性顆粒中發現。這種不溶性顆粒通常稱為松散IB或“絮狀”IB，其結構與經典IB不同。這種聚集可能是由于表達的蛋白質的過表達或毒性。為了最大化可溶性表達，通常使用兩種方法。第一種方法是通過改變培養條件，如溫度和培養基，共表達伴侶蛋白，或使用融合系統來改善表達。第二種方法是通過改變裂解條件來改善，一些實驗表明[4]0.1—1M精氨酸裂解緩沖液中可溶性蛋白質的量增加，或者，可以用含精氨酸的緩沖液提取細胞裂解后獲得的沉淀級分，以回收天然蛋白質，2M精氨酸不是的蛋白質變性劑，并且不會使蛋白質不穩定，而GdnHCl是變性劑，即使在非變性濃度下也會使蛋白質不穩定。某些蛋白質在精氨酸存在時不能很好地重折疊，但是將精氨酸加入到這些蛋白質的重折疊緩沖液，通常會導致蛋白質溶解，隨后去除精氨酸透析導致蛋白質沉淀。因此，甚至雖然這些蛋白質沒有完全（或正確）折疊，似乎精氨酸保持增加其溶解度。

2.3 抑制蛋白質聚集

精氨酸是最廣泛用于防止蛋白質聚集。首次使用精氨酸人組織型纖溶酶原激活劑復性研究。隨后，它成功地應用于酪蛋白II的復性，Fab抗體片段、白細胞介素6受體、溶菌酶，人類p53抑癌蛋白[5]等，主要原因認為精氨酸與蛋白質表面芳香族氨基酸側鏈的相互作用有助于抑制其聚集。精氨酸對未折疊蛋白質聚集的也有抑制作用，研究表明精氨酸減少了熱變性蛋白質的沉淀，即它增加了它們的溶解度。Shiraki等[6]人在8M尿素中溶解羧甲基化的溶菌酶（RCM溶菌酶）時，發現精氨酸（50mM0.5M）大大增加了可溶性RCM溶菌酶的比例，而用甘氨酸或NaCl沒有觀察到這種增溶作用。

3 結語

用于蛋白質的試劑可分為兩種：蛋白質變性劑和穩定劑，而那些效果介于兩者之間的化合物常用于蛋白質配制和純化，這些物質包括溫和的洗滌劑和精氨酸等化合物，不會使蛋白質變性，主要是通過抑制蛋白質聚集來穩定蛋白質。但是關于精氨酸抑制蛋白質聚集的機制我們還是不清楚，需要進一步探索。

參考文獻：

[1]Achim F.Purification method for proteins，in particular antibodies，utilizing a wash solution comprising arginine at high pH for the affinity chromatography step：US，9663552b2，2017530.

[2]YeX L;Yu D;Wu Y Z，etal.efficient largescale refolding technique for recovering biologically active recombinant human FGF21 from inclusion bodies.International Journal of Biological Macromolecules.2019，135：362372.

[3]Das D，Kriangkum J，NagataL L P，et al.Development of a biotin mimic tagged ScFvantibody against western equine encephalitis virus：bacterialexpression and refolding.J.Virol.Methods 2004，117，169177.

[4]Zhao D W，Liu Y D，Zhang G F，et al.Interaction of arginine with protein during refolding process probed byamide H/D exchange mass spectrometry and isothermaltitration calorimetry.Biochimica et Biophysica Acta.2015，1854：3945.

[5]Stefan B，Silke H，Johannes B，Refolding and structural characterization of the humanp53 tumor suppressor protein，Biophys.Chem.2002，96：243257.

[6]Shiraki K，Kudou M，Fujiwara S，et al.Biophysical effect of amino acids on the prevention of protein aggregation.J.Biochem.2002，132：591595.